분말김치 저장 중 젖산균 생육에 대한 동결건조보호제 첨가 효과

본 실험에 사용한 김치는 시판되는 포기김치(Daesang, Seoul, Korea)를 구입하여 pH 4.1이 될 때까지 되도록 10°C 에서 2주간 숙성한 후 동결건조용 시료로 사용하였다. 기타 실험에 사용된 시약은 특급시약을 사용하였고, 동결건조보 호제는 단당류인 glucose(Samyang Co., Seoul, Korea), 이당 류인 maltose(Daejung Chemical & Metals Co., Gyeonggi-do, Korea), lactose(Junsei Chemical Co., Tokyo, Japan) 및 sucrose (Samyang Co., Seoul, Korea)를 시중에서 구입하여 사용하였다.

숙성시킨 포기김치를 각 1 kg당 동결건조보호제 15 g씩 가하여 Blender(HMF-31005, Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄하 고, 무첨가군과 동결건조보호제 첨가군으로 구분하여 glucose, maltose, lactose 및 sucrose를 각각 1.5%(w/w) 농도 로 첨가하였다.

숙성 및 분쇄한 김치 전체 5 kg을 시료로 취하여 지퍼팩 (PE)에 소분하여 넣은 다음, -70°C의 냉동고(CLN-71UWN, Nihon freezer, Tokyo, Japan)에서 24시간 냉동시켰다. 냉동 된 시료를 동결건조기(FD80 Freezer, CUDDON, Blenheim, New Zealand) chamber에 넣고 시료 선반 온도(sample trap temp.) –12~25°C, 응축기 온도(cold trap temp.) –40°C, 압 력 10 mmTorr의 조건하에서 24시간 동안 동결건조하였다. 동결건조기 chamber 내부의 온도와 건조 중인 시료의 실제 온도는 25±1°C이었다.

동결 건조된 김치를 분말화하기 위해 powder mixer (PLS-2K, Power Mixer, K.M Tec., Icheon, Korea)의 분쇄 조건에 따라 8,000 및 14,000 rpm에서 각각 2, 6분씩 처리하 여 분말김치를 제조하였다. 제조된 4종류의 분말김치의 분 쇄조건별 품질특성의 비교는 색도, ASTA 지수 및 관능평가 를 통해 확인하였다. 동결건조보호제를 첨가한 캡슐형 분 말김치는 최종으로 선정된 조건(14,000 rpm, 2분)으로 제조 하고 분말화된 시료는 캡슐(KJ-100S, Korea Medi Co., Ltd., Daegu, Korea)에 각 350 mg씩 충진 되도록 수동방식으로 제조하였다. 제조한 시료의 저장은 유통 중의 온도를 고려 하여 냉동, 냉장, 저온, 상온의 온도로 나누어 -20, 4, 0 및 25°C에 보관처리 하였다.

김치의 수분함량은 blender(MR 5550 MCA, BRAUN, Poland)로 간 반죽(paste)상태의 시료 약 1 g을 취한 후, 적외 선 수분 측정기(MB45, Ohaus, Leicester, UK)를 이용하여 측정하였다.

김치의 이화학적 특성 분석 중 pH는 blender로 간 반죽 (paste)상태의 시료에 pH electrode(ORION 3 STAR, Thermo, Waltham, USA)를 직접 넣어 측정하였다. 적정산도 는 blender로 간 반죽상태의 시료 약 1 g을 정확히 달아 적당히 희석(100 mL) 하여 여과(Advantec No. 1)한 여과액 20 mL에 0.01 N NaOH 용액으로 pH가 8.3이 될 때까지 적정하여 소비된 0.01 N NaOH 용액 소비량을 구한 후 다음 의 식에 따라 lactic acid(%, w/w)로 환산하였다.

A: 본 시험에 소비된 0.01 N NaOH 용액의 mL

B: 바탕시험에 소비된 0.01 N NaOH 용액의 mL

f: 0.01 N NaOH 용액의 역가

D: 희석배수

S: 시료채취량(g)

김치의 염도는 blender로 간 반죽(paste)상태의 시료 약 1 g을 정확히 달아 100배 희석하여 여과한(Advantec No. 1) 여과액을 10 mL를 취하여, 2% potassium chromate 1 mL를 넣어 0.02 N AgNO₃ 용액으로 적정하여 다음의 식을 이용하여 계산하였다.

A: 본 시험에 소비된 0.02 N AgNO₃ 용액의 mL

B: 바탕시험에 소비된 0.02 N AgNO₃ 용액의 mL

f: 0.02 N AgNO₃ 용액의 역가

D: 희석배수

S: 시료채취량(g)

분말김치의 색도는 Chroma meter(CR-400, Konica Minolta, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였고, Hunter 색 차계의 L(명도, Lightness), a(적색도, redness), b(황색도, yellowness) 값을 5회 반복 측정하여 그 평균값을 나타내었 다. 이때 표준색판을 설치하여 값을 보정하였으며, 시료를 원형 cell에 넣어 측정하였다.

분말김치 시료 0.1 g을 정확히 달아 100 mL volumetric flask에 넣고 acetone으로 표선까지 채우고 1분간 shaking한 뒤 암소에 16시간 방치한 다음 460 nm에서 흡광도를 측정 하였다(10).

A: 460 nm에서 흡광도

16.4: ASTA value 색상 값을 변환하는 흡광계수

S: 시료채취량(g)

분말김치의 정량적 분석 방법의 특성을 고려한 훈련된 관능요원 10명을 선발하였고, 평가 전에 실험의 목적과 관 능적 품질 특성을 설명한 후에 관능평가를 실시하였다. 시 료는 하얀 종이컵에 담아 제공하였으며, 분말김치 자체의 맛, 색, 냄새 및 전체적 기호도를 7점 기호 척도법(1점 매우 약하다~7점 매우 강하다 또는 1점 매우 싫어한다~7점 매우 좋아한다)으로 평가하였다. 또한 검사원들은 실험을 시작 하기 전 물로 입을 헹구도록 하였고, 시료를 맛보는 사이마 다 정수된 실온상태의 물로 입을 헹구도록 하였다.

분말김치 시료 1 g 채취하여 0.85% 멸균식염수로 10배 희석하여 균질화한 후 단계 희석하여 MRS agar(Lactobacilli MRS agar, BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA)에 bromocresol purple(BCP, Fisher Scientific Co., Springfield, New Jersey, USA) 지시약을 25 ppm으로 첨가하여 제조한 배지에 pouring culture method로 접종한 후 30°C에서 48시 간 평판 배양하여 yellow 발색반응을 나타낸 colony(유기산 생성균)를 계수하였다.

자료 분석은 SPSS(18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 이용하여 평균과 표준편차를 구하였으며, 각 변수에 대해 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실 시하였다. 사후검정으로 Duncan’s multiple range test를 적 용하였으며, 통계적 유의성은 p<0.05를 기준으로 하였다.

분말김치 내의 생균(젖산균)수를 10⁷~10⁸ CFU/g으로 유 지하기 위하여 김치를 10°C에서 2주간 숙성시킨 김치의 pH, 산도, 수분 및 염도의 결과는 Table 1과 같다. 김치는 발효 숙성 시 원재료에 함유된 각종 효소와 미생물의 작용 에 의해 구성성분이 분해 및 발효되는데, 탄수화물의 분해 및 발효로 여러 가지 유기산이 생성되고 pH가 감소하고 산도가 증가하여 김치 고유의 신맛을 갖게 되므로 pH와 산도는 김치의 주요 품질 지표라고 할 수 있다(11,12). 본 실험에서 사용된 동결건조 전의 숙성김치의 이화학적 특성 을 분석한 결과, pH는 4.10±0.04이며, 산도는 1.24±0.02%, 젖산균수는 6.45×10⁸ CFU/mL, 수분함량은 86.5%, 염도는 1.87%이었다.

동결건조된 김치를 분말화하기 위해 최종 입자크기를 powder mixer의 분쇄 조건에 따라 8,000 및 14,000 rpm에서 각각 2, 6분씩 처리한 결과, 각각의 평균입도는 50, 65, 110 및 140 mesh로 분쇄 속도가 높고 분쇄 시간이 증가할수록 입자의 크기가 작게 나타났다. 분쇄조건별로 비교하기 위 해 분말김치의 품질 특성은 색도, ASTA 지수 분석 및 관능 평가를 통해 확인하였다(Table 2, 3). 색도의 결과 분쇄조건 이 L, a, b값 모두에 영향을 미치는 것으로 확인되었으며, 분말김치의 명도 L값은 분쇄 속도와 분쇄 시간이 증가할수 록 수치가 높아져 밝기가 증가하는 경향을 보였다. 적색도 a값은 입자의 크기가 작아질수록 수치가 감소하는 경향을 보였고(14,000 rpm/2, 6 min), 황색도는 적색도와 반대로 입자의 크기가 작아질수록 수치가 증가하는 경향을 보였다 (8,000 rpm/2, 6 min). 분쇄된 김치의 색은 입자의 크기에 따라 차이가 나타나는 것을 알 수 있었으며, 입자의 크기가 작을수록 빛에 대한 난반사율이 증가하여 그 값이 증가하는 것으로 생각된다(8). 김치의 붉은색은 부재료인 고춧가루 가 가장 크게 김치의 색도에 영향을 준다는 Ku 등(13)의 보고를 기준으로 동결 건조한 김치 분말을 고춧가루의 색도 를 나타내는 ASTA값을 측정한 결과 5.20-19.1의 범위로 시료간의 차이를 확인할 수 있었다. ASTA 지수는 평균 입도가 가장 작은 14,000 rpm, 6분 처리구에서 유의적으로 높게 나타났으며(p<0.05), 이는 동결김치의 미립화 조건 중 분쇄속도 및 분쇄시간에 따른 차이로써 ASTA값에 미치는 영향이 크다고 볼 수 있었다. 이러한 결과는 입자의 크기가 적색색소의 추출속도에 영향을 미치는 것이라 판단되고, 이는 크기가 작을수록 적색색소의 추출양이 증가하는 것으 로 생각된다. 따라서 분쇄속도와 분쇄시간은 분말김치의 품질지표 및 평가에 요인이 될 수 있다고 판단된다. 동결된 김치를 분쇄속도 및 분쇄시간을 달리하여 제조한 분말김치 의 붉은 정도, 잘 익은 냄새, 감칠맛, 전체적인 기호도 등의 항목에 대한 관능평가를 실시하였으며 그 결과는 Table 3 나타내었다. 그 결과, 8,000 rpm으로 분쇄 시 14,000 rpm보 다 더 붉은 것으로 인식하여 색도 결과와 유사하였으며, 냄새와 맛에는 처리구에 따른 유의차는 없는 것으로 확인되 었고, 전체 기호도는 14,000 rpm으로 6분간 처리한 시료에 서 8,000 rpm으로 2분간 처리한 시료 보다 유의적으로 높게 나타났다.

분말김치제품 중 젖산균 생존율을 높이기 위한 방법으로 흔히 사용되고 있는 당류를 첨가하여 온도에 따른 저장기간 중 젖산균의 생존율을 확인하였다. 본 실험에서는 숙성김 치에 동결건조보호제 4종을 1.5%로 첨가하고 동결건조하 여 분쇄한 다음 분말김치를 젤라틴 캡슐에 충진하여 실험에 사용하였다. 제조한 캡슐형 분말김치를 0주에서 최대 16주 까지 저장하면서 저장기간 및 저장온도별로 젖산균수의 변화를 관찰하였고, 동결건조 처리한 김치의 저장성 평가 를 실시하였다. 본 실험에 앞서 동결건조보호제의 적정 첨 가 농도를 설정하기 위해 4종의 동결건조보호제를 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0%씩 첨가하고 젖산균수를 측정한 결과 동결건조 보호제의 첨가량 대비 1.5%를 첨가하였을 때 가장 높은 균수를 나타내어 이를 최종 첨가 농도로 설정하였다. 캡슐 형 분말김치에 첨가한 동결보호제의 동결 보호 효과를 비교 하기 위해서 –20°C의 저장온도에서 4종의 동결건조보호 제(maltose, sucrose, lactose 및 glucose)의 종류별로 젖산균 수를 측정하였다. 그 결과, 동결건조보호제 무첨가군의 경 우 9주간 저장기간 동안 초기균수에서 1 log 감소하였으며, 저장 16주에는 7 log 수준을 유지하였다. Maltose를 첨가한 분말김치의 경우에는 저장 3주차에 12 log CFU/g에서 10 log CFU/g 으로 감소하였으나 저장 5주차부터 16주까지 9 log CFU/g 수준으로 무첨가군보다 높게 유지되었다.

Sucrose 및 lactose를 첨가한 분말김치의 경우 젖산균수는 저장 16주에 1 log 감소한 9 log CFU/g 수준이었으며, glucose를 첨가한 분말김치에서는 10 log CFU/g 수준을 그 대로 유지하는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 정리하면 -20°C에서 저장한 캡슐형 분말김치에서 4개월 후에도 젖산 균이 7 log CFU/g 이상 유지되었으며, glucose의 동결건조 보호제의 첨가가 캡슐형 분말김치에서는 대조군보다 3 log CFU/g 많은 10 log CFU/g 젖산균이 확인되었다(Table 4).

일반적으로 생균에 첨가하는 동결건조보호제 중 당류는 균체 농축액의 점도를 높여 동해방지 상승효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(14). 동결건조보호제는 균체에 수소결 합과 이온결합을 부여하여 세포막의 구성성분을 안정화시 켜서 세포의 손상을 예방한다고 여겨져 왔다. 동결과 건조 는 세균의 세포막에 손상을 초래하며 이와 같은 손상은 동결과 건조 전에 동결건조보호제를 첨가하여 최소화 할 수 있는 근거와 일치하는 결과를 도출하였다(15). 더불어 동결건조보호제는 세포막의 통과여부에 따라 투과형 (DMSO, glycerol 등), 반투과형(oligosaccharides, 아미노산 및 저분자량을 가진 중합체 등)과 비투과형(고분자 단백질 및 다당류 등)의 여러 종류로 나눠지는데 본 연구에서 사용 한 보호제는 비투과형에 속한다(16). 비투과형 보호제는 세포의 동결 및 해동 시 발생하는 세포손상을 방지하기 위한 세포막 비투과성 용질로 완충작용이 있어 급격한 삼투 압 변화를 줄일 수 있다고 알려져 있다(17). 특히 저농도 (0.01~0.2 M)에서 효과가 매우 좋으며, 투과형 보호제 보다 독성 또한 낮으며, 비투과성 보호제의 효과는 세포와 보호 제 종류 및 농도와의 특이성에 따라 달라진다(18). 본 연구 의 결과 중에서 저장온도와 관계없이 0주차의 초기 생균수 에서 maltose를 제외한 4군에서는 10 log CFU/g 수준으로 모두 비슷한 경향을 확인하였으며, maltose를 첨가한 김치 분말의 젖산균수가 약 12 log CFU/g을 나타내어 4가지 당 중, maltose가 가장 높은 동결보호 효과를 나타내었다. 이는 Sihn의 보고에 의하면Lactobacillus brevis의 성장을 위해서 는 glucose보다 mlatose를 탄소원으로 이용하는 것이 효과 적이며, 특히 mlatose를 2% 첨가하였을 때 가장 높은 균수 를 나타내었다(19). 또한 젖산균 성장용 배지에 첨가되는 탄소원 중 만노오스(mannose), 포도당(glucose), 과당 (fructose), 유당(lactose)을 첨가한 경우, 만노오스가 가장 우수한 탄소원으로 보고되었다(20). 더불어 젖산균은 건조 배지에 존재하는 포도당, 과당, 유당, 만노오스가 대부분의 건조기간 동안 및 저장 동안 보호효과를 발휘하였다고 보고 되었다(20). 이는 당의 종류에 따라 보호효능에 상당한 차이 로 판단되며, 이것은 미생물 종류에 따른 당 흡수 능력 및 운반 특성, 탄소원을 이용하기 위한 효소 수준의 차이로 보고 있다(20). 한편 Kilara 등(21)은 12종의 동결건조보호 제가S.thermophilus의 동결과 동결건조 후의 생존율에 미치 는 효과를 관찰하였는데, 보호제의 종류에 따라 동결 후의 생존율은 <1~67% 수준이었다. To와 Etzel(22)은 동결건조 후 젖산균의 생존율에 영향을 미치는 주요한 인자는 동결건 조보호제 뿐만 아니라 동결건조 전 젖산균의 생육조건, 생 육시기(age of culture), 동결건조 시료에 함유된 젖산균의 밀도(cell paste loading), 시료 제조방법, 동결건조 후 시료의 복원방법 등이라고 보고한 바, 상기의 실험 결과와 본 실험 의 결과가 상이한 것은 동결 방법 및 조건, 균주의 상태 등의 차이에 기인하는 것으로 판단된다. 이어 4 및 0°C에 저장된 캡슐형 분말김치에서도 저장 4개월째의 젖산균수 는 7~8 log CFU/g 으로 유지되는 것으로 확인하였다(Table 5, 6). 0°C 저장의 경우 16주간 저장한 동결건조보호제 무첨 가군(6.80 log CFU/g)과 최대 생존율을 나타낸 maltose 처리 군(8.99 log CFU/g)의 생균수를 비교하면 2.19 log CFU/g의 차이를 보였다. 4°C의 저장의 경우에서는 16주간 저장한 동결건조보호제 무첨가군(7.50 log CFU/g)과 최대 생존율 을 나타낸 maltose 처리군(8.31 log CFU/g) 및 glucose 처리 군(8.31 log CFU/g)과 생균수를 비교하면 l log 수준의 차이 를 보였다. 25°C에서 4개월간 저장하면서 생균(젖산균)수 를 측정하면서 동결건조보호 효과를 관찰한 결과 저장 10 주까지는 4~5 log CFU/g으로 젖산균수가 유지되었으나, 저장 4개월째에는 젖산균이 확인되지 않았다(Table 7).