분무건조공정을 이용한 파인애플 착즙액 미세캡슐 분말의 물리화학적 특성 및 protease 활성

본 실험에 사용된 파인애플(Ananas comosus (L.) Merr.) 은 필리핀산으로 2014년 6월 경상북도 경산시 소재의 마트 에서 구입하여 사용하였다. 미세캡슐화를 위한 피복물질은 말토덱스트린(malto-dextrin, Baolingbao biology Co., Ltd., Shandong, China)과 알긴산(alginic acid, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하였다.

파인애플의 껍질을 박피하고 가식부분을 잘게 썬 다음 분쇄기(FM-909W, Hanil Co., Sejong, Korea)로 분쇄한 후 여과포로 착즙하였다. 착즙액은 불순물을 제거하기 위하여 원심분리기(VS-6000CFN, Vision scientific Co., Ltd., Bucheon, Korea)를 이용하여 4°C, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 상등액을 Whatman No. 1로 여과한 다음 4°C의 암소에 보관하면서 실험에 사용하였다.

Protease 활성 측정은 Kunitz법(21)을 변형하여 측정하였 다. 0.2 M sodium phosphate 완충용액(pH 7.0) 1.5 mL에 시료 0.5 mL를 취한 후 0.6% casein 용액(w/v, Duksan pure chemicals Co., Ltd., Ansan, Korea) 0.5 mL를 가하여 진탕 항온수조(BS-31, Jeio tech Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하 여 37°C, 100 rpm에서 20분간 반응시킨 후 0.44 M trichloroacetic acid(TCA, Acros organics, Geel, Belgium) 2.0 mL를 넣어 반응을 중지시키고 반응액을 원심분리기 (1236MG, GYROZEN Co., Ltd., Daejeon, Korea)를 이용하 여 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 상등액 1.5 mL 를 취하여 0.55 M sodium carbonate anhydrous(Na₂CO₃) 1.0 mL와 1 N Folin ciocalteu 용액(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1.0 mL를 가하여 37°C에서 30분간 발색반 응시킨 다음 분광광도계(Ultraspec-2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하 였다. Protease 활성은 tyrosine(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였 으며, 활성단위(unit)는 1분당 1 μg의 tyrosine을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

Protease 활성에 미치는 pH의 영향을 검토하기 위하여 완충용액은 0.2 M citrate 완충용액(pH 3.0~6.0), 0.2 M sodium phosphate 완충용액(pH 6.0~8.0) 및 0.2 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.0~9.0)을 이용하여 기질을 제조하였으며, 기 질과 효소반응은 37°C에서 20분간 반응한 후 측정하였다.

Protease 활성에 미치는 온도의 영향은 0.2 M sodium phosphate 완충용액(pH 7.0)을 이용하여 기질을 제조한 후 20°C에서 80°C의 온도범위에서 20분간 기질과 효소를 반응 한 후 측정하였다. 이 외의 반응 조건은 protease 활성 측정 방법과 동일하게 진행하였다.

분무건조공정을 이용한 미세캡슐화는 파인애플 착즙액 300 mL에 20%(w/v) 말토덱스트린 및 1, 2, 3%(w/v) 알긴산 을 첨가한 다음 고압균질기(HG-15D, DAIHAN scientific Co., Ltd., Wonju, Korea)를 이용하여 6,000 rpm에서 20분간 균질화하였다. 제조된 균질액은 주입 온도 160°C, 방출 온도 100°C로 설정하였고, 분무속도는 16,000 rpm에서 시료 공 급속도는 12 mL/min의 조건으로 아토마이져(atomizer)가 장착된 분무건조기(KL-8, Seogang engineering Co., Ltd., Cheonan, Korea)를 이용하여 미세캡슐화 하였으며, –70°C 이하의 암소에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다. 대 조구로는 피복물질을첨가하지않고동결건조(FreeZone-2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA)를 이용하여 건조한 분말 을 사용하였다.

수분함량은 미세캡슐 분말을 페트리디쉬에 담아 적외선 수분측정기(MB-45, Moisture analyzer, INC., Ohaus, USA) 를 이용하여 105°C에서 분말의 수분함량이 항량에 도달할 때까지 건조하여 측정하였다. 색도 측정은 표준색도가 L=95.5, a=0.18, b=0.32로 보정된 색도계(CR-300, Minolta Co., Osaka, Japan)를 이용하여 L값(lightness), a값(redness), b값(yellowness)으로 측정하였다.

입자크기는 미세캡슐 분말을 isopropyl alcohol에 분산시켜 레이저입도분석기(LS-13-320, Beckman coulter, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.

입자표면구조는 각 시료에 gold ion coating한 후 주사형 전자현미경(S-4800, Hitachi high-Technologies Co., Tokyo, Japan)을 이용하였으며, 전자현미경을 이용한 관찰은 3.0 kV에서 500배 비율로 관찰하였다.

수분흡수지수(water absorption index, WAI) 및 수분용해 지수(water solubility index, WSI) 측정은 phillips(22)의 방 법을 변형하여 측정하였다. 미세캡슐화 분말 0.5 g에 20 mL 증류수를 첨가하여 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 한 후 침전물은 수분흡수지수로 사용하였으며, 상등액은 미리 무게를 구한 수기에 분리하여 105°C에서 4시간 동안 건조시킨 고형분을 수분용해지수로 사용하여 아래와 같 이 계산하였다.

in vitro 인체 내 소화모델에 대한 protease 활성의 안정성 을 검토하기 위하여 대한약전에 따라 인공위액 및 인공장액 을 제조하였으며, 인체 내 소화모델에 대한 실험방법은 Hur 등(23)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 2.0 g에 인공위 액 18 mL를 첨가하여 진탕 항온수조를 이용하여 37°C, 50 rpm에서 2시간 반응시킨 후 인공장액 20 mL를 첨가하여 37°C, 50 rpm에서 2시간 반응시킨 후 protease 활성 측정용 시료로 사용하였다.

실험결과는 3회 반복으로 행하여 평균±표준편차로 나타 내었고 SPSS(19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하 여 분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, 각 측정 평균값의 유의성(p<0.05)은 Duncan’s multiple range test로 검정하였다.

파인애플 착즙액의 pH, 가용성 고형분 및 protease 활성 은 Table 1과 같다. pH는 5.43이었고 °Brix는 12.80으로 높은 당도를 나타내어 분무건조를 이용한 미세캡슐 분말 제조시 수율이 높을 것으로 판단된다. Protease 활성은 4.82 unit/mL 로 나타났으며, 활성단위(unit)는 1분당 1 μg의 tyrosine을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. Yoo 등(24)은 파인애 플 유래 조효소액의 protease 활성 측정 결과 0.57 unit/mL라 고 보고하여 본 연구보다 낮은 활성을 나타내었는데, 이는 조효소액의 추출방법 및 활성단위의 정의가 다르기 때문으 로 사료된다.

파인애플 착즙액의 protease 활성에 미치는 pH 및 온도의 영향을 검토한 결과는 Fig. 1과 같다. pH의 경우 0.2 M sodium phosphate 완충용액(pH 7.0)에서 가장 높은 효소 활성을 나타내었으며 pH 3~5에서는 효소 활성이 1% 이하 로 확인 되었다. Bai 등(1)은 배, 무화과, 파인애플, 파파야에 서 추출한 조효소에 대한 pH의 영향을 조사한 결과 pH 5.0~8.0에서 안정하였고, pH 7.0에서 가장 높은 활성을 나 타내었다고 보고하였다. 온도의 경우 온도가 증가함에 따 라 활성이 점차 증가하였으며 50°C에서 가장 높은 활성을 나타내었고, 60°C 이후 효소활성이 감소하는 경향을 나타 내었으며 이는 기존 연구결과와 유사하였다(1,24). Kim 등 (25)은 키위 유래 조효소액의 경우 60°C에서 약 30% 정도의 활성만이 잔존한다고 보고하였으나 본 연구의 파인애플 착즙액은 60°C에서 97%의 활성을 나타내었고 70°C에서는 50%의 활성을 나타내어 파인애플 착즙액의 protease 활성 이 열에 더 안정함을 확인하였다.

Fig. 1. Effect of pH (A) and temperature (B) on the protease activity from pineapple juice. The reactions were performed in 0.2 M citrate buffer (●, pH 3.0~6.0), 0.2 M sodium phosphate buffer (◌, pH 6.0~8.0) and 0.2 M Tris-HCl buffer (■, pH 8.0~9.0) containing 0.6% substrate and pineapple juice at 37°C for 20 min.

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파인애플 착즙액 미세캡슐 분말의 수분함량, 색도 및 입 자크기는 Table 2와 같다. 수분함량은 동결건조 분말에서 3.02%로 가장 낮은 함량을 나타내었으며, 분무건조 미세캡 슐 분말에서 3.35~3.75%로 알긴산 첨가량이 증가할수록 낮아지는 경향이었다. Kim 등(26)의 미역과 다시마 분무건 조 분말의 수분함량이 각각 8.57% 및 11.11%로 나타났으 며, Jeong 등(27)의 분무건조 탁주분말의 수분함량이 6.64% 로 나타나 본 연구의 분무건조 미세캡슐 분말이 낮은 수분 함량을 나타냄을 확인할 수 있었다. 색도는 분무건조 미세 캡슐 분말이 동결건조 분말에 비하여 L값 및 a값은 낮고 b값은 높은 경향을 나타내었는데 특히 말토덱스트린에 알 긴산 3%를 첨가한 분말은 L값, a값 및 b값이 각각 95.63, -1.85 및 10.35를 나타내어 선명한 노란색을 보여주었다. 입자크기의 경우 동결건조 분말(501.57 μm)에 비하여 분무 건조 미세캡슐 분말이 42.58~53.32 μm로 유의적으로 낮은 크기를 나타내었으며, 말토덱스트린에 알긴산 첨가량이 높 아질수록 입자크기가 커지는 경향이었다. Hwang 등(28)은 일반적으로 1~200 μm의 분말을 미세캡슐 범위로 분포한다 고 보고하였으며, Rosenberg 등(29)은 입자크기가 작을수록 내부 물질을 포접하는데 유리하다고 한 연구결과에 따라 동결건조 분말보다 분무건조 미세캡슐 분말에서 in vitro 인체 내 소화모델에서의 안정성 향상에 기여할 것으로 기대 된다. 미세캡슐 분말의 입자표면구조를 측정한 결과 동결 건조 분말은 구형이 형성되지 않고 엉김현상으로 인해 정확 한 측정이 어려웠으나, 분무건조 미세캡슐 분말의 경우 전 반적으로 구형의 모양을 보여주어 분말 흐름성이 양호할 것으로 판단된다(Fig. 2). 분무건조 미세캡슐 분말에서 말토 덱스트린을 첨가한 분말은 입자표면에 굴곡이 많은 구형을 나타내었으나 말토덱스트린에 알긴산이 첨가된 경우, 첨가 량이 높아질수록 굴곡이 적은 구형을 나타냄을 확인하였 다. Kim 등(30)은 입자표면의 굴곡이 건조 과정에서 입자들 이 수축함에 따른 현상이라고 보고하였는데, 이에 본 연구 의 분무건조에 의한 파인애플 착즙액 미세캡슐 제조시 알긴 산의 첨가량이 높아질수록 입자표면의 수축현상이 완화되 는 것으로 판단된다.

Fig. 2. Scanning electron microscope (3.0 kV×500) of microencapsulated pineapple juice powders. FD, freeze-dried powder; SD-M, spray-dried powder added 20% maltodextrin; SD-MA-1, spray-dried powder added 20% maltodextrin and 1% alginic acid; SD-MA-2, spray-dried powder added 20% maltodextrin and 2% alginic acid; SD-MA-3, spray-dried powder added 20% maltodextrin and 3% alginic acid.

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미세캡슐 분말의 수분흡수지수 및 수분용해지수는 Table 3과 같다. 분말의 수분흡수지수 및 수분용해지수는 식품산 업 활용 측면에서 중요한 가공적성 요인으로 알려져 있으며 (31), 특히 분말의 안정성 및 붕해력과 밀접한 관련이 있다. 수분흡수지수는 말토덱스트린에 알긴산을 3% 첨가한 분무 건조 미세캡슐 분말에서 0.41로 가장 낮은 지수를 나타내었 으며 동결건조 분말에서 0.87로 가장 높은 지수를 나타내었 다. 흡습성이 클수록 고화현상의 발생이 용이하여 저장안 정성이 낮은 것으로 간주되는데(32), 분무건조 미세캡슐 분말은 알긴산 첨가량이 1%에서 3%로 높아질수록 수분 흡수지수는 각각 0.65, 0.48 및 0.41로 낮아지는 경향을 나타 내어 저장안정성이 향상됨을 확인하였다. 특히 말토덱스트 린에 알긴산 3% 첨가한 미세캡슐 분말에서 0.41의 수분흡 수지수를 나타내어 수분에 대한 분말의 안정성이 높을 것으 로 판단된다.

수분용해지수는 동결건조 분말에서 90.45%로 가장 낮은 지수를 나타내었으며 분무건조 미세캡슐 분말에서 98.22~ 99.76%로 나타나 우수하였다. 분무건조 미세캡슐 분말에 서 알긴산의 첨가량이 높아질수록 수분용해지수는 낮아졌 으나 통계적으로 유의적인 차이는 나타나지 않았다. Kim 등(33)은 건조방법에 따른 양파분말 입자의 용해도를 측정 한 결과 입자크기가 커질수록 수분용해지수가 낮아진다고 보고하여 본 연구결과와 유사하였다. 이에 알긴산을 파인 애플 착즙액 미세캡슐 제조시 피복물질로 활용할 경우 수분 의 흡습성 및 용해성을 고려하였을 때, 2~3%의 비율로 혼합 하여 사용하여야 흡습성이 낮고 용해성이 양호한 분말을 얻을 수 있을 것이라 판단된다.

미세캡슐 분말의 protease 활성 및in vitro 인체 내 소화모 델에 대한 protease 활성의 안정성을 검토한 결과는 Table 4와 같다. Protease 활성은 동결건조 분말에서 g당 1,297.47 unit으로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 분무건조 미세캡 슐 분말에서 말토덱스트린 단독 첨가시 g당 633.51 unit으로 가장 낮은 활성을 나타내었다. 특히 미세캡슐 분말에서 말 토덱스트린에 알긴산 첨가량이 증가할수록 692.08 unit/g에 서 642.65 unit/g으로 낮아지는 경향을 나타내었다. Protease 의 경우 pH 및 온도가 활성에 중요한 요소로 보고되어져 있는데, 본 실험에 이용된 파인애플 착즙액은 0.2 M sodium phosphate 완충용액(pH 7.0)에서 가장 높은 효소 활성을 나타냈으며 pH 3~5에서는 효소활성이 1% 이하임이 확인 되었다. Hur 등(23)의 연구에 따르면 인체 내 소화모델에 대한 연구에서 위액은 pH 3이하, 장액의 경우 pH 5~8 범위 를 나타낸다고 보고되고 있어 미세캡슐의 인체 내 소화모델 에 대한 protease 활성 안정성을 검토하고자 하였다. 미세캡 슐 분말의in vitro 인체 내 소화모델에 대한 protease 활성의 안정성을 검토한 결과 동결건조 분말의 경우 효소 활성이 나타나지 않았으나, 분무건조 미세캡슐 분말에서는 g당 23.70~100.83 unit의 효소 활성이 나타나 위액과 장액의 pH 환경에서 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다. 분무건조 미세캡슐 분말에서 말토덱스트린 단독 첨가시 3.74%의 낮 은 효소 안정성을 나타낸 것에 비해 말토덱스트린에 알긴산 의 첨가량이 높아질수록 효소 안정성이 높아지는 것을 확인 하였으며, 특히 알긴산 2% 및 3% 첨가 분말에서 각각 14.71% 및 15.69%로 나타나 높은 효소 안정성을 나타냄을 확인하였다. 이는 낮은 pH 수용액 상태에서 용해되지 않고 팽윤 정도가 매우 작아지는 알긴산의 특성에 기인되며(34), 이를 통해 파인애플 착즙액의 protease 효소가 생체 내 위액 과 장액의 pH 환경에서 안정하게 통과되고 장내에서 방출 되는 효과를 나타낼 것으로 판단된다.

이와 같이 분무건조에 의한 파인애플 착즙액 미세캡슐 분말의 물리화학적 특성 및 protease 활성을 분석한 결과 말토덱스트린에 알긴산을 첨가한 구간이 우수한 물리화학 적 특성 및 protease 활성을 나타내었으며, 특히 in vitro 인체 내 소화모델에 대한 protease 활성의 안정성이 높게 나타나 기능적 특성 및 가공비용 등을 고려하였을 때 알긴 산 2% 첨가량이 산업적으로 적용가능하다 판단된다.