참치 가공부산물로부터 단백가수분해물 제조 및 항산화 활성 평가

본 실험에서 사용한 참치(Katsuwonus pelamis) 가공부산물은 ㈜한라식품(경북 상주시 함창읍)에서 제공받았으며, 탈지 대두 분말은 증안리 약초마을 협동조합(경기 양평군)에서 생산된 것을 구입하였다. 또한, 갈색거저리 유충(Tenebrio molitor, mealworm)은 오엠오(전남 담양군)에서 동결 건조된 갈색거저리 유충을 구입하여 사용하였다. 모든 시료는 −20°C 동결고에 저장하며 실험에 사용하였다. Alcalase, bromelain, flavourzyme, neutrase 및 papain 단백질 분해 효소는 Novozymes사(Bagsvaerd, Denmark) 제품을 구입하였다. 가수분해도 측정을 위해 사용된 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)는 G-Bio-Sciences사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, sodium dodecyl sulfate(SDS)는 Wako Chemical사(Osaka, Japan)로부터 구입하였다. Tetramethylethylenediamine(TEMED), 30% acrylamide/bis solution 29:1은 Bio-Rad(Hercules, CA, USA)로부터 구입하였다. 그 밖의 언급이 없는 분석용 시약 및 유기용매는 모두 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

참치 가공부산물을 증류수에 현탁하여 4%(w/v)의 기질용액으로 제조한 후, 90°C에서 20분 동안 중탕시켜 자가 효소를 불활성화시켰다. 그 후 방냉하고 비효소군을 제외한 나머지 효소군들은 기질 대비 단백질 가수분해효소(alcalase, bromelain, flavourzyme, neutrase, papain)를 각각 1%(w/w)의 효소가 되도록 첨가하여 55°C, 100 rpm에서 12시간 동안 가수분해하였고, 90°C에서 20분간 가열하여 효소를 불활성화하였다. 방냉한 후 가수분해물을 13,000 × g 에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었으며, 상등액은 저분자 펩타이드의 분리를 위해 cell strainer로 여과한 후 0.22 μm membrane filter(Steritop Threaded Bottle Top Filter 250 mL, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)를 이용하여 여과하여 단백가수분해물을 얻었다. 단백가수분해물을 72시간 동안 동결 건조하였으며 −20°C의 동결고에 보관하면서 실험에 사용하였다. 가수분해물의 수율은 가수분해물 제조에 사용한 참치 가공부산물 무게 대비 동결 건조한 단백가수분해물의 무게를 %(w/w)로 나타내었다.

밀웜(갈색거저리 유충) 및 탈지 대두 단백가수분해물의 제조는 alcalase 단백질 가수분해효소를 이용하여 진행하였으며, 탈지 hemp seed 단백가수분해물 제조와 동일한 방법으로 진행하였다.

참치가공부산물 열수추출물은 분말 중량 10배(w/v)의 증류수를 첨가하여 80°C에서 3시간씩 2회 반복 추출하였으며, 30% 주정 추출물은 분말 중량 10배(w/v)의 30% 주정을 첨가하여 25°C, 120 rpm에서 18시간씩 2회 반복 추출하였다. 추출물은 여과지(Whatman No. 3, Little Chalfont, England)로 여과 후 55°C 수욕상에서 회전식 감압농축기로 농축 후 동결 건조하여 −20°C의 동결고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

효소제별 처리 시간에 따른 참치 가공부산물 단백가수분해물의 가수분해도 측정은 TNBS 방법을 이용하였다(Choi 등, 2013). 각 가수분해물은 13,000 ×g, 4°C, 10분 원심 분리하여 상등액만 취하여 이용하였다. 100 mM Sodium bicarbonate(pH 8.5) 990 μL와 1% TNBS 10 μL를 혼합(v/v)하여 0.01% TNBS를 제조하였다. 0.01% TNBS 50 μL와 효소제 처리 시간별 반응혼합액 100 μL를 섞어 37°C에서 2시간 반응시킨 후 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)와 1 N hydrogen chloride(1 N HCl)를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후 microplate spectrophotometer (Bio Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 335 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 L-tyrosine으로 표준 곡선을 작성한 후, 시료의 가수분해도를 tyrosine 함량으로 환산하여 available amino group concentration (μg/mL)을 구하였다.

각 효소별 참치 가공부산물 단백가수분해물의 단백질 가수분해 특성을 확인하기 위하여, SDS-PAGE를 이용하여 가수분해물의 단백질 패턴을 측정하였다. SDS-PAGE는 Yoon 등(2023)의 방법에 따라 수행하였다. 각 가수분해물은 13,000 ×g, 4°C에서 10분간 원심분리 후 얻은 상등액 24 μL를 15% gel에 loading한 후 80 V로 2시간 전기영동하였다. 0.1% Coomassie brilliant blue를 사용하여 염색하고 10% acetic acid가 함유된 30% methanol로 탈색시켰다. 이때 결과는 Gel Logic 2200 PRO Imaging System (Carestream Health Inc., Rochester, NY, USA)을 이용하여 polyacrylamide gel을 스캐닝한 후 이미지로 영상화시켰다.

ABTS radical 소거 활성 실험은 Yoon 등(2023)의 방법에 따라 측정하였으며, 소거 활성은 radical을 50% 저해시키는 데 필요한 농도를 RC₅₀값으로 나타내었다. 이때 활성 비교를 위하여 양성대조군으로 trolox를 사용하였으며, trolox를 사용하여 0–13 μg/mL 범위에서 표준 곡선을 작성한 후 시료의 항산화 활성을 계산하여 trolox equivalent (TE; μg TE/mg)으로 나타내었다.

H₂O₂ 소거 활성 측정은 Yoon 등(2023)의 방법에 따라 측정하였다. H₂O₂ 소거 활성은 가수분해물이 H₂O₂를 50% 감소시키는 데 필요한 농도를 RC₅₀값으로 나타내었다. 이때 활성 비교를 위한 양성대조군으로 trolox를 사용하여 0-13 μg/mL 범위에서 표준 곡선을 작성한 후 시료의 항산화 활성을 계산하여 trolox equivalent(μg TE/mg)으로 나타내었다.

2-Deoxy-D-ribose 산화 억제 활성은 Yoon 등(2023)의 방법에 따라 측정하였다. 2-Deoxy-D-ribose(10 mM), FeSO₄ · 7H₂O(10 mM), ethylene-diamine-tetraacetic acid(EDTA; 10 mM) 용액을 각각 100 μL 가한 반응 용액에 증류수에 희석한 일정 농도(250, 500, 1,000 μg/mL) 시료 용액 100 μL, 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) 500 μL, 10 mM H₂O₂ 100 μL를 가하여 최종 반응액이 1 mL가 되도록 혼합한 후 37°C에서 4시간 반응시켰다. 반응 용액 100 μL에 10% trichloroacetic acid (TCA, w/v) 50 μL를 가하여 반응을 정지시킨 후 1% thiobarbituric acid(TBA, w/v) 50 μL를 가하여 95°C에서 10분간 반응시킨 후 냉각하여 100 μL의 상등액을 microplate spectrophotometer를 이용하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성 비교를 위하여 양성대조군으로 butylated hydroxyanisole(BHA)을 사용하였다.

Linoleic acid에 대한 산화 억제 활성은 Yoon 등(2023)의 방법에 따라 측정하였다. Absolute alcohol 1 mL, 5% linoleic acid 1 mL, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) 2 mL와 시료 1 mL를 혼합한 후 40°C에서 100 rpm으로 진탕하며 하루 간격으로 thiobarbituric acid (TBA)를 측정하여 각 시료의 linoleic acid에 대한 산화 억제 활성을 측정하였다. 20% TCA(w/v) 100 μL, 0.8% TBA(w/v) 100 μL와 linoleic acid 반응기질 용액 50 μL를 잘 혼합하여 95°C 이상에서 20분간 반응하였다. 반응 용액을 20°C, 1,850 ×g에서 15분간 원심분리하여 180 μL의 상등액을 흡광도 532 nm에서 측정하였다. 이때 활성 비교를 위한 양성대조군으로서 trolox를 사용하였다.

모든 데이터는 최소 3번 반복하여 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 통계 분석에는 SPSS Statistics 26(Statistical Package for the Social Science, Version 26.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)가 사용되었다. 또한, 그룹 간의 유의성 차이 검증에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 사용하였으며, Duncan’s multiple range test 방법을 통한 사후 검증을 시행하였다. 유의확률(p-value)이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

총 5종(alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain)의 효소를 이용하여 참치 가공부산물로부터 단백가수분해물의 제조 특성을 조사하기 위해 우선 TNBS assay를 이용하여 처리 시간별로 available amino group의 농도를 측정함으로써 효소별 시간에 따른 가수분해도의 차이를 확인하였다. 단백질의 가수분해도에 비례하여 available amino group 농도가 증가하는데, 이는 가수분해도를 나타내는 지표가 될 수 있다(Choi 등, 2013). 효소별로 시간에 따른 가수분해도를 tyrosine 함량으로 환산하여 나타낸 결과, 12시간 반응 후 available amino group의 농도는 alcalase군 3.44 mg/mL, flavourzyme군 3.26 mg/mL, neutrase군 2.99 mg/mL, bromelain군 2.88 mg/mL, papain군 1.64 mg/mL, 비효소군 1.33 mg/mL로 각각 확인되었다(Fig. 1). Alcalase군, bromelain군, neutrase군은 0-24시간 동안 available amino group 농도가 조금씩 증가하였으며, flavourzyme군의 경우 12시간 이후부터 그 증가 폭이 현저히 감소하는 경향을 보였다. 한편, papain군의 경우 24시간 처리에도 불구하고 가수분해도의 유의한 증가를 보이지 않았으며, 높은 가수분해도를 나타낸 효소군들의 경우 8시간 또는 12시간이 경과한 시점의 available amino group 농도가 24시간 동안 가수분해한 결과와 유의적인 차이가 크지 않은 것으로 보아 8-12시간이 적절한 효소 처리 시간임을 알 수 있었다.

Fig. 1. Degree of hydrolysis of tuna byproducts by five different proteases at 55°C on TNBS assay. Each value is mean±SD (n≥3) and different superscripts (a-e) are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

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Je 등(2009)은 참치 가공부산물인 참치 간을 8시간 동안 효소적 가수분해하였을 때, alcalase, flavourzyme, neutrase 중 flavourzyme이 가장 높은 가수분해율을 보였다고 보고하였다. 본 연구 또한 8시간 경과하였을 때, available amino group의 농도가 flavourzyme군 2.95 mg/mL로 가수분해도가 가장 높았으며, alcalase군 2.91 mg/mL, neutrase군 2.75 mg/mL, bromelain군 2.44 mg/mL, papain군 1.62 mg/mL, 비효소군 1.33 mg/mL 순으로 나타났다. 참치 가공부산물의 8-12시간 가수분해도를 비교하였을 때 papain군과 비효소군을 제외한 나머지 효소군의 가수분해도가 증가한 것으로 보아 12시간을 최적의 효소 처리 시간으로 판단하였다.

12시간 동안 가수분해를 진행한 효소별 참치가공부산물 단백가수분해물의 분자량 분포를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 실시한 결과, 비효소군의 분자량 분포와 비교하였을 때 효소군의 경우 전반적으로 10 kDa 이상의 단백질은 거의 나타나지 않고 10 kDa 이하로 분해된 것을 확인할 수 있다(Fig. 2). 이는 TNBS assay 결과와 유사하게 12시간 효소 처리 후 단백질의 가수분해가 충분하게 이루어졌으며, alcalase가 다른 효소에 비해 상대적으로 가수분해 효율이 우수함을 확인할 수 있었다.

Fig. 2. SDS-PAGE profile of tuna byproduct hydrolysates. SDS-PAGE gel (15%) was used. Lane [1]: no-enzyme; Lane [2]: bromelain; Lane [3]: papain; Lane [4]: alcalase; Lane [5]: flavourzyme; Lane [6]: neutrase.

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따라서 본 연구는 TNBS assay 및 SDS-PAGE 결과를 바탕으로 가수분해 시간을 12시간으로 설정하고, 참치가공부산물을 각각의 효소로 가수분해하였다. 이때 각 단백가수분해물의 제조 수율을 측정한 결과는 Table 1과 같다. Alcalase를 이용한 단백가수분해물의 수율이 15.15%로 가장 높았으며, bromelain군 14.48%, neutrase군 12.13%, flavourzyme군 8.87%, papain군 4.70%, 비효소군 3.15% 순으로 나타나 TNBS assay 결과와 유사한 경향임을 알 수 있었다. 동물성 및 식물성 유래의 다양한 단백질 원료를 대상으로 가수분해물을 제조한 선행연구 결과(Yoon 등, 2023; Yu 등, 2017)에 따르면 단백가수분해물의 제조 수율이 낮게는 20% 이상에서 높게는 40% 이상을 보였던 반면, 참치 가공부산물의 경우 단백가수분해물의 제조 수율이 상대적으로 낮은 것을 확인할 수 있으며, 이는 본 연구에 사용된 참치 가공부산물이 오랜 시간 훈제 및 가열 과정에 의해 단백질이 과변성되어(Song 등, 2011) 가수분해에 부정적 영향을 끼친 것으로 생각된다.

ABTS와 potassium persulfate의 반응에 의해 생성된 ABTS⁺ free radical에 대한 각 단백가수분해물의 소거 활성을 측정하였다. ABTS radical에 대한 RC₅₀값은 flavourzyme군 77.29 μg/mL, alcalase군 83.70 μg/mL, bromelain군 88.43 μg/mL, neutrase군 89.57 μg/mL, papain군 155.96 μg/mL, 비효소군 180.97 μg/mL로 나타나 papain을 제외한 모든 효소군에서 비효소군 대비 우수한 ABTS radical 소거 활성을 보였다(Table 2). 그 중 flavourzyme군의 RC₅₀값이 타 효소군들에 비해 큰 차이는 아니지만 유의적으로 낮은 값을 보여 flavourzyme 단백가수분해물의 ABTS radical 소거 활성이 가장 높은 것을 알 수 있었다.

H₂O₂는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 하나로 대사 과정에서 많이 생성되어 DNA 손상, 세포 내 단백질 변성, 세포막 산화 등을 통해 생체 기능 저하, 노화, 성인병 등을 유발하는 주범으로 작용하며, 따라서 H₂O₂ 소거 활성은 항산화제의 기능을 평가하기 위한 유용한 방법 중 하나이다(Lee 등, 2010; Yu 등, 2017). 효소별 참치 가공부산물 단백가수분해물의 H₂O₂ 소거능을 RC₅₀값으로 나타낸 결과, flavourzyme군 65.96 μg/mL, neutrase군 107.50 μg/mL, bromelain군 109.89 μg/mL, alcalase군 116.38 μg/mL, papain군 159.67 μg/mL, 비효소군 315.54 μg/mL로 나타나 효소군이 비효소군 대비 유의적으로 높은 H₂O₂ 소거 활성을 보였다(Table 3). 특히 flavourzyme 단백가수분해물 경우 타 효소군에 비해 월등히 낮은 RC₅₀값을 보여 H₂O₂ 소거 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. TEAC값 또한 flavourzyme군이 가장 높았으며, 비효소군 대비 flavourzyme 단백가수분해물의 RC₅₀값과 TEAC값 모두 5배 이상 차이를 보였다.

2-Deoxy-D-ribose 산화 억제 활성 측정 실험은 H₂O₂와 Fe²⁺의 반응으로 생성된 hydroxyl radical에 의해 생성되는 2-deoxy-D-ribose의 산화물인 malondialdehyde의 양을 측정함으로써 항산화 활성을 측정하는 방법이다(Lee 등, 2005; Mayank 등, 2014).

각 시료의 농도별 2-deoxy-D-ribose 산화 억제율을 양성대조군인 BHA(50 μM)의 억제 활성과 함께 나타낸 결과는 Fig. 3과 같다. 모든 단백가수분해물이 비효소군에 비해 처리 농도가 증가함에 따라 유의적으로 높은 산화 억제율을 보였다. 특히 flavourzyme군의 경우 상기 실행한 두 가지 ROS 소거 실험 결과와 같이 다른 효소군에 비해 250-500 μg/mL 농도 구간에서 산화 억제율이 높았음을 확인할 수 있다. 위 결과들로부터 효소군이 비효소군에 비해 hydroxyl radical에 의한 산화를 효과적으로 저해함을 알 수 있으며, 단백가수분해물의 처리 농도가 높아짐에 따라 산화 억제율이 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 상기 두 가지 ROS 소거 실험 결과 papain군이 다른 효소군에 비해 항산화 활성이 낮았으나 본 실험에서는 250 μg/mL 농도 구간에서 neutrase군, 500 μg/mL 농도 구간에서는 bromelain군보다 높은 산화 억제율을 보였다. 이는 효소별 가수분해로 인해 생성되는 펩타이드 및 아미노산이 다르며 이로 인해 항산화 실험에 따른 항산화 효과가 차이를 나타내는 것으로 생각된다.

Fig. 3. 2-Deoxy-D-ribose inhibitory effects of BHA and tuna byproduct hydrolysates with different proteases. Each value is mean±SD (n≥3) and different superscripts (a-d) at the same concentration are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

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앞선 ROS 소거 활성 실험들에서 가장 우수한 활성을 보였던 flavourzyme 단백가수분해물을 이용하여 지질 과산화 억제 활성을 조사하였으며, 과산화물 생성량은 Yu 등(2017)의 방법에 따라 TBA가 측정을 통해 확인하였다. 즉 불포화 지방산인 linoleic acid의 과산화로 생성되는 malonaldehyde와 같은 저분자 활성 화합물이 TBA와 결합하여 적색의 화합물을 형성하는 원리를 이용하여 지질 과산화물 생성 억제 활성을 측정하였다.

Flavourzyme 단백가수분해물(TPF; 100 μg/mL)의 linoleic acid에 대한 산화 억제 활성은 양성대조군인 trolox(2 μg/mL) 및 비효소군과 비교하여 시간별로 확인하였으며, 반응 시간에 따른 흡광도 변화율은 Fig. 4와 같다. Linoleic acid는 반응 3일째를 시작으로 4일째부터 급격한 지질 과산화가 진행되었으며, trolox를 비롯하여 모든 시료 처리군이 반응 5일째까지 유의적인 지질 과산화 억제 활성을 나타내었다. 한편, 반응 6일째에는 TPF와 trolox의 경우 대조군 대비 다소 낮은 과산화물 생성량을 보였지만 통계학적 유의성은 관찰되지 않아 모든 처리군이 과산화 억제 활성을 보이지 않았다. 반응 5일째부터 지질 과산화 억제 활성이 낮아졌으나 TPF와 비효소군을 비교하였을 때 TPF의 지질 과산화 억제 활성이 높은 것으로 보아 앞선 다양한 항산화 실험에서 나타난 결과들과 상응하는 양상임을 알 수 있었다.

Fig. 4. Inhibitory effects of trolox and TPF on linoleic acid peroxidation. Each value is mean±SD (n≥3) and different superscripts (a-c) at the same day are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

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앞선 실험에서 우수한 항산화 활성을 보인 TPF를 이용하여 참치 가공부산물로부터 제조한 추출물(열수 추출물 및 30% 주정 추출물)과 항산화 활성을 비교하였다. ABTS radical 소거 활성의 경우 동일한 처리 농도(100 μg/mL)에서 TPF 56.71%, 열수 추출물 처리군 21.93%, 30% 주정 추출물 처리군 9.44%로 나타났으며, H₂O₂ 소거 활성의 경우 TPF 57.97%, 열수 추출물 처리군 21.45%, 30% 주정 처리군 22.85%로 나타났다(Fig. 5). 이 결과들로 볼 때 참치 가공부산물의 단순한 추출물에 비해 단백가수분해물의 항산화 활성이 우수한 것을 확인할 수 있으며, 이는 가수분해물 제조 시 생성되는 다양한 종류의 저분자 펩타이드들이 가지는 항산화 활성에 기인하는 것으로 판단된다.

Fig. 5. Comparison of antioxidant activities of TPF and other natural antioxidants. Each value is mean±SD (n≥3) and different superscripts (a-e) at the same concentration are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

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또한 선행연구(Castro와 Sato, 2015; Yu 등, 2017)에서 우수한 항산화 활성이 보고된 밀웜(갈색거저리 유충) 및 탈지 대두 유래 단백가수분해물과의 항산화 활성도 함께 비교하였다. 밀웜과 탈지 대두는 선행연구에서 가장 높은 항산화 활성을 보였던 alcalase를 이용하여 단백가수분해물을 제조하였으며, 이들과 TPF의 항산화 활성을 동일한 처리 농도(100 μg/mL)로 비교한 결과, 밀웜 alcalase 단백가수분해물은 TPF와 유사한 ROS 소거 활성을 보인 반면 탈지 대두 alcalase 단백가수분해물의 경우 TPF에 비해 유의적으로 낮은 활성을 보였다(Fig. 5).

본 연구는 참치 가공부산물 단백가수분해물 제조를 위한 최적의 효소제를 선발하였으며, 단백가수분해물의 항산화 활성을 확인하였다. 활성산소 중 radical 소거 활성 실험인 ABTS radical 소거 활성과 비radical 소거 활성 실험인 H₂O₂ 소거 활성에서 flavourzyme군이 가장 높은 소거 활성을 보였다. 또한, DNA의 기본 구성 요소인 2-deoxy-D-ribose hydroxyl radical에 의한 산화를 단백가수분해물이 억제하는지 확인하기 위하여, 2-Deoxy-D-ribose 산화 억제 활성 평가를 진행한 결과, ROS 소거 활성 평가와 같이 다른 효소군과 비교하였을 때, flavourzyme군이 250-500 μg/mL 농도 구간에서 높은 산화 억제율을 보였다. TPF는 지질 과산화 억제 활성 실험의 반응 5일째에서 비효소군과 비교하였을 때 유의적인 억제 활성을 보였으며, 다른 식용 소재 유래의 단백가수분해물들과 항산화 활성 비교에서 유사하거나 우수한 항산화 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 이를 통해 새로운 천연 항산화 소재로서 참치 가공부산물의 높은 활용 가치를 확인할 수 있었다.