침출 조건이 감잎차의 색 및 항산화 특성에 미치는 영향

본 실험에 사용된 감잎 분말은 2021년 9월에 경북 영천에서 생산된 것으로서 한약재시장/삼홍건재약업사에서 구입하여 사용하였다. 첫째로, 용매당 사용되는 시료 양의 영향을 확인하기 위하여, 감잎 분말과 증류수의 비율을 달리하여 증류수 100 mL당 10, 50, 100, 200, 500 또는 1,000 mg 감잎 분말을 각각 가하여 최종 농도가 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 또는 10 mg/mL가 되도록 하였다. 각 침출액을 100°C에서 60분 동안 가열 후 filter paper(Chmlab Group, Barcelona, Spain)로 여과하여 얻은 여액을 감잎차(persimmon leaf tea, PLT)로 명명하고 실험에 사용하였다. 다음으로, pH의 영향을 확인하기 위하여, 10 mg/mL로 용매당 시료 양은 고정하되, McIlvaine 완충용액(0.1 M citric acid and 0.2 M dibasic sodium phosphate)을 사용하여 침출액의 pH가 4, 5, 6, 또는 7이 되도록 제조하였다. pH는 SevenCompact^TM pH meter(Mettler Toledo, Columbus, OH, USA)를 이용하여 측정하였으며, 각 침출액을 100°C에서 60분 동안 가열 후 filter paper로 여과하여 얻은 여액을 실험에 사용하였다.

침출액 내 시료의 양 또는 용매 pH 조건에 따라 제조한 각 PLT 1 mL를 직경 1.55 cm의 24-well plate의 각 well에 담아 흰 종이 위에서 색도를 측정하였다. 색차계(Minolta, CR-300, Konica Minolta Co., Tokyo, Japan)를 사용하여, L=93.7 a=0.3130 b=0.3194의 색도를 나타내는 표준판(calibration plate)으로 보정한 후, 각 PLT에 대해 명도(L, lightness), 적색도(a, redness) 및 황색도(b, yellowness)를 5회 반복 측정하였다. 각 PLT 간의 색차(color difference, ΔE)는 가장 낮은 농도인 0.1 mg/mL PLT를 대조군으로 선정 후 분석하였으며 계산식은 하단 식과 같다. 또한 폰카메라(Galaxy S20 plus SM-G986N, Samsung Electronics Inc., Suwon, Korea)를 이용하여 처리 조건에 따른 샘플들을 함께 촬영하여 색상을 비교 관찰하였다.

각 PLT의 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능은 Brand-Williams의 방법을 변형하여 측정하였다(Brand-Williams 등, 1995). 즉, 각 조건별 PLT 25 μL와 0.02% DPPH 125 μL를 혼합하여 SpectraMax^® ID3(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)을 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 기존의 알려진 항산화제인 ascorbic acid(Kanto Chemical, Tokyo, Japan)를 표준물질로 사용하여 얻은 표준곡선으로부터 시료 용액의 DPPH 라디칼 소거능을 구하였으며, 측정단위는 mg ascorbic acid equivalent(mg AAE)/mL를 사용하였다.

각 PLT의 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 소거능은 Biglari의 방법으로 분석하였다(Biglari 등, 2008). 즉, 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 1:1로 혼합한 후 차광 상태로 16시간 동안 반응시킨 후 증류수로 희석하여 734 nm에서의 흡광도값이 0.70±0.02가 되도록 ABTS 용액을 제조하였다. 이후, 각 조건별 PLT 10 μL와 ABTS 용액 190 μL를 혼합하여 6분간 상온에서 반응시킨 후 SpectraMax^® ID3(Molecular Devices)을 이용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. Trolox를 표준물질로 사용하여 얻은 표준곡선으로부터 시료 용액의 ABTS 라디칼 소거능을 구하였으며, 측정단위는 μmol trolox equivalent(μmol TE)/mL를 사용하였다.

각 PLT의 환원력은 Benzie의 방법을 변형하여 측정하였다(Benzie와 Strain, 1996). 즉, 300 mM sodium acetate buffer(pH 3.6), 40 mM HCl에 녹인 10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazine, 그리고 20 mM ferric chloride를 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 37°C에서 20분간 반응시켜 FRAP 반응액을 준비하였다. 이후, 각 조건별 PLT 10 μL에 10 μL의 증류수와 100 μL의 FRAP 반응액을 첨가하여 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. Ascorbic acid를 표준물질로 사용하여 얻은 표준곡선으로부터 시료 용액의 환원력을 구하였으며, 측정단위는 mg AAE/mL를 사용하였다.

각 PLT 내 총폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법을 이용하여 분석하였다(Singleton 등, 1999). 각 조건별 PLT 10 μL에 20 μL의 10% Folin-Ciocalteu 반응액을 혼합하고 80 μL의 700 mM sodium carbonate를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 95% methanol에 녹인 gallic acid(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준물질로 사용하여 얻은 표준곡선으로부터 시료 용액의 총폴리페놀 함량을 구하였으며, 측정단위는 mg gallic acid equivalent(mg GAE)/mL를 사용하였다.

각 PLT 내 총플라보노이드 함량은 aluminum chloride법으로 측정하였다(Zhishen 등, 1999). 각 조건별 PLT 25 μL에 125 μL의 증류수와 10 μL의 5% sodium nitrite solution을 혼합하여 6분간 방치 후, 15 μL의 10% aluminum chloride hexahydrate를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시켰다. 여기에 50 μL의 1 M sodium hydroxide와 125 μL의 증류수를 첨가한 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총플라보노이드 함량은 catechin (Sigma-Aldrich)의 표준곡선으로부터 구하였으며 측정단위는 mg catechin(mg CE)/mL를 사용하였다.

모든 실험은 3회 이상 반복 실시하였고 결과치를 평균±표준편차로 표시하였다. 실험결과는 SPSS 통계프로그램(version 27.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였다. 각 실험군 간 차이는 유의확률 p<0.05에서 one-way ANOVA 및 Duncan’s multiple range test로 검증하였다.

차의 색은 음용 이전에 시각적으로 호소하여 차로서 입맛을 돋우는 역할을 할 수 있어, 차의 품질 평가 시 중요한 요소가 될 수 있다. 따라서 시료와 용매의 비율(w/v)에 따른 품질 특성의 지표로서 색도를 측정한 결과를 Table 1에 나타내었다. 용매 물 대비 시료 감잎분말의 양이 많아질수록 밝기를 의미하는 L값은 낮아지는 경향을, 황색을 나타내는 b값은 높아지는 경향을 나타냈다. 이러한 색의 변화는 Fig. 1에서도 확인되었다. 적색을 의미하는 a값은 0.1 mg/mL에서 5 mg/mL 범위 내에서는 시료의 양이 증가할수록 낮아지는 경향을 보였다. 반면, 10 mg/mL의 a값은 0.1 mg/mL와 유사한 수준을 나타내었다. 색의 차이를 나타내는 ΔE값은 용매 대비 시료의 양이 많아질수록 높아지는 경향을 보였으며, 용매 대비 시료의 양이 가장 높은 10 mg/mL에서 17.52±0.03으로 색의 차이 값이 가장 큰 것으로 나타났다. 추출 조건에 따른 감잎차의 색 변화는 찐차(steamed tea)와 볶음차(roasted tea)의 전처리 조건에 따라 분석된 바 있다(Kim과 Oh, 1999). 이는 감잎 시료 2 g에 물 200 mL를 가해 추출처리를 한 것으로, 본 실험에서의 가장 높은 농도인 10 mg/mL 조건에 해당된다. 해당 연구 결과에 따르면 찌는 시간이 증가할수록, 또는 볶음 시간이 증가할수록, 각각 L값은 감소하고 a값, b값 및 ΔE값은 증가하는 것으로 보고되어, 본 연구에서 침출시킨 시료의 양이 증가하는 것과 전처리 시간이 증가하는 것이 유사한 색도 변화 양상을 나타내는 것으로 사료된다. 이때, 차의 색, 향, 맛의 3가지 관능평가도 수행되었으며, 전처리 시간이 증가할수록 색, 향, 맛의 전체적 기호성이 우수한 것으로 평가되었다.

Fig. 1. Changes in colors of persimmon leaf tea (PLT) by different amounts of solute per solvent. PLT was prepared by boiling different amounts (0.1, 0.5, 1, 2, 5, or 10 mg) of persimmon leaf powder in 1 mL of water for 60 min. Color of PLT extracted from different amounts of persimmon leaf powder was visualized via camera.

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시료와 용매의 비율(w/v)에 따른 기능성 지표로서 항산화력을 측정하여 Table 2에 나타내었다. 용매 대비 시료의 양이 많아질수록 DPPH 라디칼 소거능이 증가하는 경향을 보였으나 5 mg/mL와 10 mg/mL군 간의 소거능 값은 차이가 없었다. ABTS 라디칼 소거능은 모든 실험 조건에서 추출용매 대비 시료의 양이 많아질수록 증가하는 것으로 나타나, 가장 높은 비율인 10 mg/mL 조건에서 0.908±0.003 μmol TE/mL값을 보였다. FRAP법에 의한 항산화 활성 또한 유사한 경향을 나타내어 시료의 양이 많을수록 높은 값을 보였다. 일반적으로 차 내 풍부한 성분으로 알려진 폴리페놀은 감잎차 찻물에서 열, 초음파, 또는 발효 처리 등과 같은 제조방법의 차이에 따라 용출량이 달라지는 것으로 보고된 바 있다(Kim 등, 2012). 또한, 감류 내 건조 상태 및 부위에 따라 곶감, 생감 및 감잎 추출물의 폴리페놀 함량 및 DPPH 라디칼 소거활성을 비교 분석한 선행연구는 항산화 활성의 원인 물질이 규명되지 않은 곶감에 비해, 감잎의 항산화 활성은 폴리페놀 함량에 기인함을 보고하였다(Hong 등, 2008).

본 실험에서는 추출용매 대비 PLT 시료의 양이 많아질수록 총폴리페놀 및 총플라보노이드 함량이 높아지는 것으로 분석되어 가장 높은 비율인 10 mg/mL 조건에서 각각 0.219±0.010 mg GAE/mL 및 0.107±0.003 mg CE/mL값을 보였다. 그러나 본 연구에서의 총폴리페놀 값은 10 mg/mL 동일 농도 조건이면서 본 실험 조건 대비 낮은 온도 및 짧은 시간 동안에 침출시킨 선행연구의 값, 즉 약 90°C에서 1분간 침출한 본 실험 조건 대비 낮은 온도 및 짧은 시간 동안에 침출시킨 감잎차의 총폴리페놀 함량 0.394 mg GAE/mL에 비해 절반 정도인 적은 양으로 사료된다(Lim 등, 2008). 다른 연구에서는 시료와 추출용매 비율 15 mg/mL(감잎 1.5 g을 100 mL의 증류수에 침출시킴) 조건이면서 약 90°C에서 3분간 침출하였을 때 0.023-0.042 mg GAE/mL의 총폴리페놀 함량을 보고한 바 있다(Son 등, 2020). 따라서 침출 시 시료의 농도와 침출 시간이 폴리페놀 용출에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 이와 같은 항산화력 관련 지표 분석 결과, 시료의 양이 가장 많은 10 mg/mL에서 항산화 기능성이 가장 우수한 것으로 파악되어, 이후 pH에 따른 추가 분석은 10 mg/mL 조건으로 수행하기로 하였다.

추출 용매의 pH에 따른 차 품질 특성을 알아보기 위하여 pH가 다르도록 제조한 McIlvaine 완충용액으로 침출시킨 각 PLT의 색도를 측정하고, 그 결과를 Fig. 2와 Table 3에 나타냈다. pH 4와 7 사이에서 용매의 pH가 높아질수록 밝기를 의미하는 L값은 낮아지는 경향을, 황색을 나타내는 b값과 색의 차이를 나타내는 ΔE값은 높아지는 경향을 나타냈다. 적색을 의미하는 a값은 pH 7에서 5.25±0.03으로 가장 높았고, pH 5에서 −2.68±0.04로 가장 낮았으며 pH에 따른 경향성은 나타나지 않았다. 색차계 분석에서 확인된 pH가 높아질수록 황색도가 높아지고, 특히 pH 7에서 적색도가 높아지는 차이는 육안으로도 확인할 수 있었다(Fig. 2). 현재까지 침출차의 pH 조건에 따른 색도 변화에 대한 연구들은 많지 않은 실정이다. 녹차 침출수 pH가 녹차 침출액의 색도 변화에 미치는 영향 연구에 따르면, pH 6과 pH 7 사이에 황색을 나타내는 b값이 급격히 증가하였다. 해당 연구에서는 이를 천연형 카테킨류의 이성체가 증가하여 녹차의 갈변이 급속히 진행되는 것으로 고찰하였다(Kim 등, 1999). 본 연구에서는 카테킨을 포함하는 총폴리페놀 함량이 pH 6에 비해 pH 7에서 유의적으로 감소하였다. 후속 연구에서는 감잎차의 pH에 따른 색도 변화가 녹차와 유사하게 카테킨 함량의 변화로 인한 것인지 추가 분석이 요구되는 바이다.

Fig. 2. Changes in colors of persimmon leaf tea (PLT) prepared by an aqueous solvent with different pH conditions. Persimmon leaf powder (10 mg) was extracted using 1 mL of aqueous solvent with different pH (pH 4, 5, 6 or 7) for 60 min. Color of PLT extracted under different pH conditions was visualized via camera.

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추출 pH에 따른 PLT의 항산화력을 측정한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거능은 pH 5에서 0.137±0.000 mg AAE/mL로 가장 높은 값을 나타냈으며, pH 4(0.131±0.001 mg AAE/mL)와 pH 6(0.130±0.000 mg AAE/mL)에서 유사한 수준으로 낮았다. 반면, pH 7에서는 0.084±0.001 mg AAE/mL의 값을 나타내 DPPH 라디칼 소거능이 급격하게 낮아지는 것으로 분석되었다. FRAP법에 의한 항산화 활성은 pH가 증가될수록 낮아지는 경향을 보여 pH 4에서 0.137±0.008 mg AAE/mL로 가장 높은 값을, pH 7에서는 0.060±0.007 mg AAE/mL로 가장 낮은 값을 나타냈다. ABTS 라디칼 소거능은 군 간 차이가 있었으나 pH에 따른 값의 범위가 0.936-0.941 μmol TE/mL로 그 차이는 미비한 수준이었다. 따라서 ABTS 라디칼 소거능을 제외한 두 결과를 종합하면 pH가 낮을수록 항산화 활성이 높아지는 것으로 사료된다. DPPH 라디칼 소거능과 환원력은 pH 7에서 모두 가장 낮은 값을 나타났는데, 이는 선행 녹차 침출 연구에서 pH를 4, 5, 6, 및 7로 조정하여 침출 시 pH가 높아질수록 총 카테킨 함량이 감소하는 경향을 나타내며, 특히 pH 7에서 급격하게 감소한 것과 유사한 결과였다(Kim 등, 1999). 해당 연구에서는 산성조건에서 억제되었던 카테킨의 이성화(epimerization) 반응이 pH 7에서 빠르게 진행된 결과인 것으로 분석 결과를 고찰하였다. 감잎 내 카테킨 함량은 0.18-0.35 mg/100 g(dry weight)으로 품종별로 차이를 보이며 녹차의 0.07 mg/100 g(dry weight)에 비해 높은 것으로 분석된 바 있다(Jung 등, 2004). 따라서 녹차 침출수 연구결과와 유사하게 감잎차 내 카테킨의 이성화 반응에 따라 pH 7에서 카테킨에서 비롯된 항산화 활성이 저해되어, 산성 pH 범위에 비해 급격한 항산화력 감소가 나타난 것으로 사료된다. 또한, pH에 따른 색도 변화에 따르면 pH 6에서 pH 7로 변화 시 a값에 해당하는 적색이 음의 값에서 양의 값으로 급격히 변화하는 것으로 측정되었다(Table 3).

Fig. 3. Antioxidant activity of persimmon leaf tea (PLT) prepared by solvent with different pH conditions. Antioxidant capacity of PLT extracted under different pH condition (10 mg of persimmon leaf powder in 1 mL McIlvaine buffer solution with pH 4, 5, 6 or 7) was measured. (A) DPPH radical scavenging activity is expressed in mg ascorbic acid equivalent per mL of PLT (mg AAE/mL). (B) ABTS radical scavenging activity is expressed in μmol trolox equivalent per mL of PLT (μmol TE/mL). (C) Ferric reducing activity is expressed in mg ascorbic acid equivalent per mL of PLT (mg AAE/mL). Values represent mean±SD (n=5). Different letters indicate significant difference by one-way ANOVA followed by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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항산화 활성은 시료의 총폴리페놀 함량과 총플라보노이드 함량과 연관성을 가진다고 보고되어 있으므로(Dai와 Mumper, 2010; Yun 등, 2018), 그 함량을 측정하여 Fig. 4에 나타내었다. 총폴리페놀과 총플라보노이드 함량은 pH 4에서 각각 0.232±0.006 mg GAE/mL와 0.116±0.004 mg CE/mL로 가장 높은 값을 나타내었다. pH 5와 7 사이에서 용매의 pH 증가에 따라 총폴리페놀 함량은 감소하는 경향을 나타내었으나, 총플라보노이드 함량은 pH에 따른 함량 차이를 보이지 않았다. 항산화성을 가지는 물질 중 하나인 녹차의 카테킨류의 pH에 대한 안정성 연구에 따르면 pH가 낮은 산성에서 카테킨이 안정적으로 유지되므로, 차류 기능성 성분을 효율적으로 이용하기 위해서 pH를 낮게 유지하는 것이 권장된 바 있다(Park 등, 2002). 더 앞선 연구는 침출수의 pH를 낮게 유지하는 것이 녹차 고유의 색을 유지하고 카테킨 침출량을 증가시킨다고 보고하였다(Kim 등, 1999). 감잎 내 카테킨은 최소 1.5에서 최대 33.4 mg/100 g, fresh weight) 함량으로 존재하는 것으로 보고된 바 있다(Chung 등, 1994). 따라서 pH가 낮은 범위에서 높은 항산화력 경향이 나타낸 결과는 감잎 내 카테킨 양에 기인하였을 가능성이 고려될 수 있다.

Fig. 4. Total polyphenol and flavonoid contents in persimmon leaf tea (PLT) prepared under different pH conditions. Antioxidant substances in PLT extracted under different pH conditions from 4-7 (10 mg of persimmon leaf powder in 1 mL McIlvaine buffer solution with different pH) was determined. (A) Total polyphenol content is expressed in mg gallic acid equivalent per mL of PLT (mg GAE/mL). (B) Total flavonoid content is expressed in mg catechin equivalent per mL of PLT (mg CE/mL). Values represent mean±SD (n=5). Different letters indicate significant difference by one-way ANOVA followed by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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본 실험은 감잎차 제조에 있어 침출 온도와 시간을 각 100°C와 60분으로 고정하여 수행하였다. 실험조건 설정을 위한 예비실험에서는 60, 80 또는 100°C 조건 및 10, 30, 또는 60분 등 총 9가지 조건에서 DPPH 라디칼 소거 활성과 총폴리페놀 함량을 비교 측정하였고, 추출 온도 및 시간에 따른 차이가 나타나지 않았다(data not shown). 침출 온도와 관련된 선행연구에 따르면 고온 조건에서 항산화 물질 섭취 증가가 유리하다. 즉, 제주산 진피 침출차의 기능성 연구에서 60, 80 또는 100°C에서 침출차 제조 시, 라디칼 소거능이 각각 33.3%, 60.1%, 또는 63.4%를 나타냈다. 다만, 함께 실시한 관능평가 결과에서는 100°C와 같은 고온에서 차를 침출하여 음용 시 여러 가지 향기와 떫은 맛 성분들이 함께 우려 나와 기호도가 80°C 침출차에 비해 낮았다(Yoo 등, 2005). 최근에 수행된 제주 타타리메밀침출차의 침출 조건 연구에서도 60°C 또는 80°C 조건에 비해 100°C에서 침출 시, 플라보노이드 함량, 주요 유효성분인 rutin 함량 그리고 DPPH 라디칼 소거 활성 및 tyrosinase 저해 활성이 가장 높게 나타났다(Ko 등, 2022). 침출 시간과 관련하여 현재까지 이루어진 감잎차 연구에서는 20분간 가열 후 여액으로 카테킨을 동정하거나(Shin, 1997), 1, 3, 5 또는 10분간 침출하여 감잎차 내 폴리페놀 성분의 주기능지표인 SOD 유사활성을 비교하여 10분에서 가장 높은 활성을 확인하였다(Park 등, 1995). 또한, 30, 50 또는 70분 등의 침출 조건에 따른 오과차 연구에서는 침출시간이 길수록 유효성분인 유리당 및 유리아미노산의 함량이 증가하였다(You, 1994). 따라서 예비 실험 결과 및 앞서 언급한 선행연구들을 근거로 본 실험에서는 최대 항산화력을 기대할 수 있는 최대 시간 60분 및 최고 온도 100°C를 침출차 제조의 기본 조건으로 설정하고 실험을 수행하였다.

본 연구 결과에 따르면 낮은 pH에서 침출시킨 감잎차에서 가장 높은 항산화력을 기대할 수 있다. pH를 보정한 버퍼가 아닌 일반 증류수로 감잎차를 제조하였을 때 pH는 약 5.25로 측정되었고, 이는 찜 공정 또는 볶음 공정의 전처리 후 제조한 감잎 찐차 또는 볶음차에서 감잎 전처리 조건에 따라 측정된 산도값인 pH 5.2-5.8 범위와 유사한 범위이다(Kim와 Oh, 1999). 해당 연구에서는 색, 향 등의 기호성 및 가용성 고형분 함량, 추출수율 등의 품질평가만 실시되었고 본 연구와 같은 항산화 기능성은 검정되지 않았다. 따라서 본 실험조건과 같은 건조 분말로 바로 침출시키는 경우 또는 선행연구와 같은 찌기 또는 볶기 등의 전처리를 거친 분말로 만든 감잎 침출차의 기능성을 좋게 하기 위해서는 pH 2 범위의 레몬이나 라임 등을 약간 첨가하여 차를 음용하는 것이 권장될 수 있겠다.