한국형 총식이조사 및 UV/태양광 조사 버섯에서의 비타민 D 분석

총식이조사(total diet study, TDS)를 위해 국민건강영양조사 제6-7기(2016년-2018년) 원시자료를 활용하여 분석한 내용을 토대로 일상적으로 섭취하는 식품을 대상 식품으로 선정하고, 식품별 해당 조리법을 분류한 뒤 조리법별 섭취량 비율을 고려한 ‘대표 식품×대표 조리법’으로 구성하여 섭취 직전의 상태로 조리한 것을 시료로 사용하였다. 시료 수집 시 지역적 대표성을 고려하여 전국을 3개의 권역(서울․경기권, 전라․충청권, 강원․경상권)으로 구분하고, 권역별 3개의 도시(‘서울, 인천․수원’, ‘광주, 대전, 청주’, ‘부산, 대구, 울산’ 총 9개 도시)의 인구 규모를 고려하여, ‘서울’, ‘인천’, ‘수원’, ‘부산’, ‘대구, 울산’, ‘대전, 광주, 청주’로 ‘대표 식품×대표 조리법’당 최대 6개의 지역별 시료를 식품의약품안전처의 한국형 총식이조사 수행 지침서에 제시된 방법을 준수하여 조제된 것을 냉동상태로 보관하였으며, 실험 시 상온으로 해동하여 사용하였다. 비타민 D 주요 급원 식품으로 알려진 항목을 식품성분표(제9개정판)를 참고하여 선정해 조리법별로 분석을 진행하였다. 선정된 품목은 버섯류 3종, 어패류 10종, 알류 1종, 육류 7종, 두류 1종, 유류 4종, 가공식품 3종, 유지류 1종으로 총 30종이며, ‘대표 식품×대표 조리법’은 새송이버섯(굽기) 등 21종 조리법 44쌍이며, 조리하지 않은 식품 두유, 우유 등 9종을 포함하여 총 53종의 식품을 대상으로 하였다. 총 53종 대상 식품에 대해 지역별로 채취한 6개 식품 중에서 1개씩 분석하고, 비타민 D가 검출된 19종 식품에 대해서는 지역별 6개 식품을 모두 분석하여 총 148건의 분석을 진행하였다.

본 연구에 사용한 비타민 D의 표준품 ergocalciferol (Vitamin D₂, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), cholecalciferol(Vitamin D₃, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)은 각각 1,000 mg/L가 되도록 메탄올로 조제하여 사용하였다. 전처리에 사용되는 피로갈롤․에탄올 용액은 피로갈롤(Sigma Aldrich, St. Louist, MO, USA)을 에탄올(Daejung Chemicals, Si-heung, Korea)에 녹여 조제하였다. BHT(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 헥산(J.T Baker, Center Valley, PA, USA)에 녹여 0.01% BHT를 함유하는 헥산으로 조제하여 사용하였고, 수산화칼륨(Daejung Chemicals, Si-heung, Korea)을 초순수에 녹여 1 N, 0.5 N으로 조제하여 사용하였다. 페놀프탈레인(Daejung Chemicals, Si-heung, Korea)은 메탄올(J.T Baker, Center Valley, PA, USA)에 녹여 사용하였다. 수세한 헥산 탈수용으로 무수황산나트륨(Daejung Chemicals, Si-heung, Korea)을 사용하였다. 전처리 용매는 메탄올(J.T Baker, Center Valley, PA, USA), 헥산(J.T Baker, Center Valley, PA, USA)을 사용하였고, 물은 초순수장치(Milli-Q, Millipore, Billerica, MA, USA)로 18 MΩ 이상의 초순수를 사용하였다. 기기분석 용매로는 HPLC 등급의 메탄올(J.T Baker, Center Valley, PA, USA)에 아세트산암모늄(Daejung Chemicals, Si-heung, Korea)을 녹여 사용하였다.

비타민 D의 분석은 식약처 고시 ｢식품의 기준 및 규격｣의 분석법을 사용하였다.

시료 약 1 g을 비누화 플라스크에 취하여 10% 피로갈롤·에탄올 용액 40 mL를 가한 후 약하게 진탕 혼합한다. 90% 수산화칼륨 용액 10 mL를 가하고 환류냉각기를 부착하여 비등수욕 중 60°C에서 1시간 가열하여 비누화 후 분리하여 즉시 실온으로 냉각한다. 비누화 플라스크 속 추출액을 250 mL 폴리에틸렌 병에 옮긴다. 이때 초순수로 비누화 플라스크 속 남아있는 추출액을 씻어내어 모두 취한다. 250 mL 폴리에틸렌 병에 0.01% BHT를 함유하는 헥산 50 mL를 가하고 10분간 강하게 진탕한다. 진탕 후 층 분리가 될 때까지 방치한 뒤 헥산 층을 250 mL 갈색 분액깔때기로 옮긴다(층 분리가 원활하지 않을 때는 4°C, 3,500 rpm에서 10분간 원심분리). 남은 하층에 헥산 추출용매 50 mL를 넣어 총 2회의 추출을 진행한다. 추출용액에 1 N 수산화칼륨 용액 100 mL를 가하여 15초간 강하게 진탕 후 방치하여 층을 분리하고 혼탁한 물 층을 버린다. 그 뒤 남은 헥산 층에 0.5 N 수산화칼륨 용액 40 mL를 가하여 진탕한 후 방치하여 층을 분리하고 물 층을 다시 버린다. 헥산 층에 증류수를 약 100 mL 첨가하여 15초간 강하게 진탕 후 방치하여 층을 분리하고 혼탁한 물 층을 버린다. 세척된 물이 페놀프탈레인 시액으로 알칼리 반응을 나타내지 않을 때까지 수 회 반복하여 수세한다. 수세한 헥산 층에 무수황산나트륨을 약 15 g 넣고 진탕하여 탈수 후 헥산 층을 갈색 둥근바닥 플라스크로 옮기고, 무수황산나트륨을 헥산 10 mL로 2회 세척한 후 탈수한 헥산 용매와 합하고, 이를 40°C 이하에서 감압 농축한다. 농축한 시료에 메탄올 2 mL를 가하여 잔류물을 녹인 후 멤브레인 필터(PTFE, 0.22 μm)로 여과하여 LC-MS/MS (LC-8050, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 Table 1과 같다.

통계분석은 SAS 9.4(SAS Institute, Cary, NC, USA)의 survey procedure를 이용하여 국민건강영양조사의 연도별 통합가중치와 분산추정층, 집락추출을 고려하여 분석하였다.

비타민 D 분석방법에 대한 유효성 검증을 위해 Codex 가이드라인(CAC/GL 71-2009)에 따라 검량선의 직선성(linearity)을 확인하였다. 비타민 D₂는 10-100 μg/kg의 농도범위, 비타민 D₃는 5-100 μg/kg의 농도범위에서 0.999 이상의 correlation coefficient값을 얻었다. 정확성(accuracy)을 확인하기 위하여 표준물질을 매질에 첨가(spiking)하여 분석의 모든 과정을 통해 얻은 결과값(spike recovery)으로 정확도(회수율)를 계산하였다. 회수율 실험 시 비타민 D₂는 볶은 표고버섯에 12.5 μg/kg의 수준으로, 비타민 D₃는 삶은 계란에 25 μg/kg 농도 수준으로 첨가하여 3회 반복실험을 하였으며, 회수율 결과는 비타민 D₂는 93.7±5.3%, 비타민 D₃는 96.9±5.1%로 codex 허용범위 80-110%를 만족하는 결과를 얻을 수 있었다. 검출한계(limit of detection, LOD)는 시료에 존재하는 분석 대상물질을 검출할 수 있는 최소농도로, 검량선의 최저농도를 7회 측정하여 분산(variance, S)과 표준편차(SD)를 계산한 후 표준편차(SD)×3.3/S로 계산하였다. 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 표준편차(SD)×10/S값으로 계산하였다. 비타민 D₂의 LOD는 0.005 mg/kg, 비타민 D₃의 LOD는 0.002 mg/kg으로 본 분석방법이 적합함을 보여주었다.

비타민 D 분석방법에 대한 검증을 위해 인증표준물질(certified reference material, CRM)을 사용하였다. NIST(National Institute of Standard and Technology, NIST) SRM1849a(Infant/Adult Nutritional Formula-I)로 검증한 결과, 비타민 D₃ 인증값 0.111 mg/kg에 대해 3반복 분석결과 0.107 mg/kg의 값을 얻었고, 회수율 96.7±8.8%의 결과를 얻었다.

비타민 D 분석에 대한 숙련도를 평가하기 위하여 영국의 국제 분석 관리프로그램인 FAPAS(Food Analysis Performance Assessment Scheme)의 숙련도 프로그램(proficiency tests) 21115(infant formula)에 참여하였고, 허용범위(󰠐Z󰠐⟨2) 이하인 −1.6의 적합한 결과를 얻을 수 있었다.

본 연구에서는 식품 30종에 대해 ‘대표 식품×대표 조리법’으로 조리된 시료 총 148건에 대하여 비타민 D를 분석하였으며, 분석결과는 Table 2와 같다. 어류 중 고등어(굽기)는 39.1-120.2 μg/kg, 고등어(부치기)는 24.2-49.4 μg/kg으로 검출되었고, 멸치(볶기)에서는 29.0-124.0 μg/kg으로 검출되어, 멸치(볶기)가 분석한 어류 9종 중 가장 높게 검출이 되었다. 가다랭이(그대로)는 11.6-29.2 μg/kg으로 검출되었고, 가다랭이(볶기)는 7.6-24.6 μg/kg, 가다랭이(끓이기)는 5.4-17.3 μg/kg으로, 그대로와 볶기보다 끓이기에서의 농도가 낮게 검출되었다. 오징어(볶기)는 7.6 μg/kg으로 검출되었고, 명태/동태(끓이기), 새우(볶기), 홍합/진주담치(볶기), 가리비(굽기), 굴(그대로)에서는 검출되지 않았다. 검출되지 않은 품목에 대해 식품성분표(9개정판) 결과를 비교해 보았을 때, 명태(구운 것)에서 13 μg/kg으로 검출되었지만, 명태(생것)에서는 검출되지 않았다. 홍합, 가리비, 굴의 경우는 식품성분표(9개정판)에서도 검출이 되지 않았다. 생선을 가공한 어묵은 ND-13.4 μg/kg으로 검출되었고, 달걀은 ND-33.1 μg/kg의 농도로 비타민 D₃가 검출이 되었다. 달걀은 노른자에서 비타민 D₃가 더 높은 농도로 존재한다고 알려져 있는데, 이번 분석에서는 시료 수집 시 흰자와 노른자를 분리하지 않고 달걀 전체를 균질화하여 분석하였다. 닭고기와 쇠고기의 경우, 모든 조리법에서 검출이 되지 않았고, 돼지고기(굽기)에서 12.2 μg/kg, 돼지고기(볶기)에서 7.7 μg/kg의 농도로 검출이 되었다. 이는 쇠고기와 닭고기에 비해 돼지고기에 지방이 많아 육류 중 높은 농도로 검출이 된 것으로 보인다. 두유에서는 3.1-15.3 μg/kg의 농도로 검출이 되었고, 콩은 버섯처럼 식물성 sterol에서 비타민 D₂가 생성이 되는 것으로 알려져 있는데, 검출된 성분은 비타민 D₃로, 이는 비타민 D 강화 제품이 포함되어 나온 결과로 확인된다. 유제품의 경우, 식품성분표(제9개정판)에서 강화 우유를 제외한 모든 우유에서 검출되지 않았고, 본 연구에서 유제품 중 우유와 치즈에서는 검출되지 않았지만, 요구르트(액상)에서는 136.9 μg/kg의 높은 농도로 검출이 되었다. 가공식품 중 과자 종류에서는 비타민 D가 검출되지 않았으나, 시리얼에서는 4.5-155.1 μg/kg의 높은 농도로 검출이 되었는데, 이는 비타민 D₃를 강화한 제품이 포함된 결과로 보여진다. Shrapnel과 Truswell(2006)에 따르면 비타민 D₂가 버섯류에서 발견된다고 알려져 있으나, 버섯류(새송이버섯, 느타리버섯, 표고버섯)에서는 비타민 D₂가 검출이 되지 않았다. Zhu와 Okamura(1995)에 따르면 버섯에 비타민 D₂가 생성되려면 버섯 속 식물성 sterol인 ergosterol이 자외선에 의해 광분해하여 ergocalciferol이 되는데, 이러한 과정이 시료 수집 과정에 포함되지 않아 검출되지 않은 것으로 간주된다.

버섯의 식물성 sterol인 ergosterol이 자외선에 의해 광분해되어 비타민 D₂가 생성된다고 알려져 있으나, 총식이조사를 위해 조제된 버섯(새송이버섯, 느타리버섯, 표고버섯)의 분석 결과, 비타민 D₂가 검출이 되지 않았다. 이에 자외선 노출에 의한 비타민 D₂ 생성을 확인하기 위해 실험을 진행하였다. 버섯의 종류는 일반적으로 많이 섭취하는 5종(표고버섯, 목이버섯, 팽이버섯, 느타리버섯, 새송이버섯)으로 선정하였다. 햇빛 노출시간은 1시간, 3시간, 6시간(표고버섯의 경우만 12시간)으로 하여 실내와 실외에서 비교실험을 진행하였다. 노출시간에 따른 버섯의 건조무게(노출시간 전․후 무게)를 측정하여 수분 보정된 함량을 비교하였다. 실험 시 버섯은 500 g을 사용하였고, 분석은 1회로 진행하였다. 실내에서 창문에 1시간 햇빛에 노출하였을 때 목이버섯을 제외한 모든 버섯에서 비타민 D₂가 검출되지 않았다. 실외에서 햇빛에 노출 시간을 다르게 하여 분석한 결과, 생표고버섯의 경우 1시간 노출 시 비타민 D₂는 35.5 μg/kg에서 12시간 노출 시 303.4 μg/kg으로 약 8.5배 높아졌다. 건조 표고버섯은 실외에서 햇빛에 1시간 노출시켰을 때 47.9 μg/kg, 12시간 노출시켰을 때 1,520.2 μg/kg으로 약 31.7배 높아짐을 확인할 수 있었다. 팽이버섯은 6시간 노출했을 때 1시간 노출시킨 결과값보다 1.4배, 느타리버섯의 경우는 3.5배, 새송이버섯의 경우는 2.7배 높아짐을 확인하였다. 실험한 버섯 모두 햇빛에 노출시킬수록 비타민 D₂가 높아졌고, 그중 건조 표고버섯이 다른 버섯에 비해 높아짐을 확인하였다. Lim 등(2022)에 따르면 자연 건조한 표고버섯에서 77.59± 12.82 μg/100 g 양송이버섯에서 68.81±1.18 μg/100 g, 큰느타리버섯 62.33±4.51 μg/100 g으로 비타민 D₂ 함량이 높아짐을 확인하였다. 목이버섯은 다른 버섯과는 다르게 가공 공정(그대로, 데친 것, 잘라서 건조한 것, 그대로 건조한 것)에 따른 비타민 D₂의 농도 차이가 없었다고 보고되었는데, 본 연구에서도 실내와 실외 햇빛 노출 시간별 농도가 비슷하게 검출되었다(Lim 등, 2022). 목이버섯의 경우, 구매한 시료에서 비타민 D₂의 농도가 500-700 μg/kg으로 존재해 있었고, 햇빛 노출시간보다는 원시료의 차이로 보여진다(Table 3). 표고버섯의 경우, 햇빛에 노출시킨 형태(버섯의 위, 아래)에 따라 비타민 D₂ 농도의 차이를 확인하고자, 노출형태를 1) 구매 시 포장 그대로, 2) 포장을 제거한 뒤 갓이 위로 향하도록 한 ‘∩’ 모양, 3) 주름이 위를 향하도록 한 ‘∪’ 모양까지 총 3가지의 형태로, 버섯을 햇빛에 노출할 때 형태를 다르게 하여 실험을 하였다. 표고버섯의 경우, 비타민 D₂의 농도가 ‘∩’ 모양으로 1시간 노출시켰을 때에는 7.5 μg/kg, ‘∪’ 모양으로 1시간 노출시켰을 때 52.8 μg/kg으로, ‘∩’ 모양에 비해 ‘∪’ 모양으로 건조 시 약 7배 높아짐을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 하지만 햇빛에 노출시켜 실험을 진행할 경우, 날씨의 영향을 많이 받아 날씨가 흐린 날 버섯에서 비타민 D₂가 생성되는지 확인하기는 어려웠다. Choi(2017)의 연구에서 햇빛 속 자외선이 아닌 자외선램프를 이용하여 UV-B를 조사 후 비타민 D₂의 전구체인 ergosterol이 비타민 D₂로 전환됨을 확인한 것을 참고하여, 자외선 건조기에 표고버섯을 넣어 자외선을 노출시키는 실험을 진행하였다. 햇빛 노출한 결과와 마찬가지로 자외선 건조기에 넣어 자외선을 노출시킨 건조 표고버섯의 비타민 D₂의 농도가 ‘∩’ 모양으로 30분 노출시켰을 때에는 115.7 μg/kg, ‘∪’ 모양으로 30분 노출시켰을 때 235.4 μg/kg으로 ‘∩’ 모양에 비해 ‘∪’ 모양으로 건조 시 약 2배 높아짐을 확인할 수 있었다. Ko 등(2008)에 따르면 슬라이스된 버섯을 자외선 조사하는 것이 전체 버섯의 주름이나 갓을 조사하는 것보다 조사 노출 면적이 크기 때문에 비타민 D₂의 함량이 더욱 증가한다고 보고되었고, 이에 따라 노출되는 면이 많은 건표고버섯(슬라이스)을 자외선 조사하여 비타민 D₂의 생성을 확인하였다. 자외선에 노출시키지 않은 건표고버섯(슬라이스)의 비타민 D₂ 농도는 수분 보정한 결과 67.3 μg/kg이었고, 자외선에 30분 노출한 건표고(슬라이스)의 비타민 D₂ 농도는 수분 보정한 결과 394.4 μg/kg으로 약 5.8배 높게 검출됨을 확인할 수 있었다(Table 4).

Fig. 1. Different types of sunlight exposure to the shiitake mushrooms. (A) wrap-packed and unpacked shiitake mushrooms, (B) “∩” shaped shiitake mushrooms without wrapping, (C) “∪” shaped shiitake mushrooms without wrapping.

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위 분석 결과를 토대로 개인별 식품섭취량 자료, 개인별 가중치를 적용하여 SAS 9.4(SAS Institute, Cary, NC, USA)의 survey procedure를 이용하여 추정한 비타민 D₃의 1인 1일 평균 섭취량은 0.99 μg/day(불검출을 0으로 처리)이었다. 극단섭취자(95th percentile)의 섭취량은 4.24 μg/day로 평균 섭취량의 약 4.3배, 50th 퍼센타일(중위수) 섭취량의 15.1배이었고, 결과는 Table 5와 같다. 평균 섭취량을 토대로 비타민 D₃ 섭취에 주로 기여하는 식품을 확인하면 요구르트/액상(31.3%)의 기여율이 가장 높았으며, 달걀(28.1%), 시리얼(11.4%), 고등어(9.6%), 두유(7.5%), 멸치(4.5%), 가다랑어(3.5%), 어묵(1.3%), 요구르트/호상(1.3%), 오징어(0.7%), 돼지고기 가공품, 햄(0.7%)의 순이었다. 위의 섭취 기여율 상위 5가지 식품에 의한 노출량이 전체 노출량의 88.0%이었고, 분석결과는 Table 6과 같다.