데침 시간에 따른 섬쑥부쟁이의 항산화 활성 및 비타민 B₂ 함량 변화

본 실험에 사용한 섬쑥부쟁이(A. glehni)는 2022년 4월 경북 울릉군에서 재배된 것을 구입하여 실험 재료로 사용하였다.

섬쑥부쟁이 중량 1 kg을 기준으로 10배(10 L)의 물을 끓이다가 95°C 이상이 되었을 때 섬쑥부쟁이를 넣고 데침 시간별(1분, 2분, 3분, 4분, 5분)로 데친 후 건져 5배의 냉수로 3회 헹굼을 하였다(Fig. 1). 헹굼 처리한 섬쑥부쟁이는 1시간 동안 자연적으로 물기를 빼고, 시료의 균일성을 위하여 동결건조한 다음 분쇄하여, 40 mesh로 체질하여 −20°C의 냉동고에 보관하면서 분석에 사용하였다. 각 데침처리에 따른 데침은 3반복을 실시하였다. 섬쑥부쟁이 추출액은 건조 분말 1 g에 90% 메탄올 100 mL를 가하여 실온에서 1시간 교반(180 rpm)한 후 여과지(Whatman No. 2, GE Healthcare, IL, USA)로 여과하여 총폴리페놀, 총플라보노이드, 항산화능 분석에 사용하였다.

Fig. 1. Photograph of Aster glehni based on blanching time.

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총폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법(Singleton 등, 1999)을 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 각 추출물 시료 용액 0.3 mL에 50% Folin & Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.3 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시킨 뒤, 10% Na₂CO₃ (Sigma-Aldrich Co.) 용액 0.3 mL를 가하여 혼합한 뒤 실온에서 1시간 반응시킨 다음, SPECTROstar^Nano(BMG LABTECH, Ortenberg, Germany)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 0-50 μg/mL의 농도로 증류수에 녹여 표준곡선을 구하고, g gallic acid equivalent (GAE)/100 g dried sample로 함량을 표기하였다.

총플라보노이드 함량 측정은 Yoon 등(2016)의 방법을 변형하여 섬쑥부쟁이 추출액 0.4 mL에 0.5% NaNO₂ (Sigma-Aldrich) 0.12 mL를 가하여 혼합한 뒤, 실온에서 5분간 반응시킨 후 1% AlCl₃·6H₂O(Daejung Chemicals Co., Siheung, Korea) 0.12 mL를 가하여 3분간 반응시켜 0.5 N NaOH(Junsei Chemical Co., Tokyo, Japan) 0.16 mL를 넣어 교반한 후 SPECTROstar^Nano(BMG LABTECH)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 catechin(Sigma-Aldrich Co.)을 0-200 μg/mL의 농도로 증류수에 녹여 검량곡선을 구하고, g catechin equivalent (CE)/100g dried sample로 함량을 표기하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정을 위한 시약으로 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)(Sigma-Aldrich Co.) 12 mg에 80% 에탄올 100 mL를 가하여 녹인 후, 50% 에탄올을 이용하여 517 nm에서 흡광도값 1.0으로 조정하여 DPPH 용액을 조제하였다. 섬쑥부쟁이 추출액 0.3 mL에 조제한 DPPH 용액 3 mL를 가하여 실온에서 5분간 반응하여 교반한 뒤 SPECTROstar^Nano(BMG LABTECH)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성(%)은 [1 − (시료 용액 첨가군의 흡광도 / 무첨가군의 흡광도)] × 100으로 계산하였다.

ABTS 라디칼 소거능 측정을 위한 시약은 7 mM 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) (Thermo Scientific, MA, USA) 용액과 potassium persulfate(Sigma-Aldrich Co.) 용액을 1:1로 혼합(v/v)하여 실온의 어두운 곳에서 24시간 동안 방치시킨 뒤, 734 nm에서 흡광도값 1.0으로 조정하여 ABTS 용액을 조제하였다. 섬쑥부쟁이 추출액 0.3 mL에 조제한 ABTS 용액 2.7 mL를 가하여 실온에서 5분간 반응하여 교반한 뒤 SPECTROstar^Nano(BMG LABTECH)를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성(%)은 [1 − (시료용액 첨가군의 흡광도 / 무첨가군의 흡광도)] × 100으로 계산하였다.

균질화된 건조 분말 시료 약 1 g에 증류수 20 mL를 첨가한 후 80°C의 조건에서 30분간 환류 추출하였다. 추출액을 9,190 ×g, 30분간 원심분리(CR 22N, Himac, Ibaraki, Japan)하고, 0.2 μm syringe filter(Chromdisc, Hwaseong, Korea)를 이용하여 상등액을 여과한 후 분석에 사용하였다. 비타민 B₂의 HPLC/FLD(high performance liquid chromatography/fluorometric detector) 분석에는 Shimadzu Prominence HPLC system(LC-20AD pump, RF-20A XS fluorescence detector, SIL-20A auto sampler, CBM-20A controller, Shimadzu co., Tokyo, Japan)을 이용하였다. 분석용 칼럼은 SCINChrom C 18G (250 mm×4.6 mm, 5 μm. Scinco, Seoul, Korea)를 사용하였고, 칼럼 온도는 40°C, 분석 파장은 여기 파장(excitation) 445 nm, 방출 파장(emission) 530 nm로 설정하여 분석하였다. 이동상 용매는 75:25(v/v) 비율의 10 mM NaH₂PO₄(pH 5.5) 및 메탄올 용매를 이용하여 분당 유속 0.8 mL로 분석을 실시하였다. 비타민 B₂의 경우, 식품 중에서 유리형인 리보플라빈 혹은 탄수화물 및 단백질과 결합한 복합체 상태로 존재하며, 주로 인산 결합형인 riboflavin-5’-adenosyl diphosphate(FAD) 및 riboflavin-5’-phosphate(FMN) 형태로 발견된다(Kim 등, 2002). 따라서 본 연구에서 표준물질로 FAD, FMN, riboflavin(Sigma-Aldrich Co.)의 농도를 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 μg/mL로 초순수를 이용하여 제조한 후, 분석한 area값과 표준용액 농도 간의 검량곡선을 구한 후 식품공전(MFDS, 2022)에 따라 riboflavin으로 환산하여 나타내었다. 또한, 분석법의 정확성은 분석 품질관리를 위해 인증값이 제시된 표준참고물질 SRM 1546a, SRM 3234를 위 추출법으로 추출한 후 분석하여 미국 국립 표준기술소(NIST)에서 제시한 인증 참고값(reference value)과 비교하여 회수율(%)로 나타내어 확인하였다.

모든 데이터는 3회 반복 측정하였으며, mean±SD로 표현하였다. 또한 얻어진 결과를 통계프로그램(Statistical Analysis System; version 9.2, SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 각각의 변수에 대한 특성을 분석하였으며, 각 시험 구간의 평균차이에 대한 유의성 검정은 Duncan’s multiple range test를 이용하여 p⟨0.05 수준일 때 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다.

폴리페놀은 식물에서 발견되는 화학물질로 총폴리페놀의 함량은 항산화와 관계가 있는 것으로 알려져 있다(Ra 등, 1997). 섬쑥부쟁이 데침 시간에 따른 총폴리페놀 함량 분석 결과, 데침 시간이 경과함에 따라 총폴리페놀 함량이 유의적으로 감소하였다(p⟨0.05, Fig. 2). 데침 전 섬쑥부쟁이의 총폴리페놀 함량은 건조 시료 기준으로 2.16 g GAE/100 g이었으며, 1-5분 데침 시간에서 총폴리페놀 함량은 무처리군 대비 각각 13.05%, 33.71%, 36.84%, 50.44%, 52.96%로 감소하였다. Jung 등(2007)에 의하면 총폴리페놀 함량은 신선한 참취에 비하여 데치기 조건에 따라 49.5%-54.4%의 감소를 나타내었다고 하여 본 연구와 유사함을 알 수 있었다. Lee 등(2011)의 연구에서 다양한 종류의 산채 추출물의 총폴리페놀 함량은 데침 처리 후 감소되는 것으로 보고하였으며, 이는 데침 공정 중 수용성인 폴리페놀 물질이 소실된 것으로 보고하였다. 또한, Lutz 등(2011)의 연구에서는 총폴리페놀은 데칠 때 산화로 인한 열분해와 항산화제의 손실 및 물속으로의 침출에 의해 그 함량이 감소하는 것으로 보고하였다. Seo(2013)의 연구에 의하면 섬쑥부쟁이의 항산화능을 나타내는 페놀산 성분이 caffeic acid, protocatechuic acid, 4-hydroxybenzoic acid, salicylic acid, vanillic acid, ferulic acid, cinnamic acid인 것으로 보고하였는데, 이러한 성분들이 데침에 의한 열분해 또는 데침물로 용출이 되었을 것으로 추측된다. 또한, Jung 등(2007) 연구에서 참취 데침 시 1% 가염하였을 때 총폴리페놀 35.9% 감소 억제를 나타내며, 2% 가염 시 80.4% 감소 억제를 나타낸다고 하였다. 따라서 추후 연구에서는 데침 시 폴리페놀 성분들의 함량 감소를 억제할 수 있는 조리법으로 가염처리를 고려할 필요가 있을 것으로 판단된다.

Fig. 2. Changes in the contents of total polyphenols in Aster glehni based on blanching time. Total polyphenol contents are expressed as gallic acid equivalents (GAE). Values represent the mean±SD (n=3). Mean with different letters above a bar are significantly different at p⟨0.05.

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플라보노이드는 식물성 폴리페놀계 화합물의 가장 큰 부류이며, 항산화 물질이다(Jeong 등, 2014). 플라보노이드의 약리작용은 항암효과, 혈관보호 효과, 항염증 효과 등 산화에 의한 손상을 저해하는 것으로 알려져 있다(Ahn 등, 2007). 데침 섬쑥부쟁이의 플라보노이드 함량을 분석한 결과, Fig. 3에서와 보는 바와 같이 데침 시간이 경과함에 따라 유의적으로 감소하였다(p⟨0.05). 데침 전 섬쑥부쟁이(1.36 g CE/100 g dryed sample)와 비교했을 때 1-5분 데침 시 총플라보노이드 함량은 각각 36.63%, 67.22%, 71.41%, 76.85%, 81.75% 감소하였다. 이는 총폴리페놀 함량 변화와 마찬가지로 데침 과정에서 플라보노이드가 조리수로 용출되어 나왔기 때문인 것으로 판단된다. Seo(2013)에 따르면 섬쑥부쟁이 플라보노이드 성분으로 astragalin, hyperoside, kaempferol, rutin, quercetin, cosmosiin, luteolin, quercitrin이 검출되었다고 보고하였으며, 이들 성분들 중 일부의 수용성 물질들이 조리수로의 용출이 되었을 것으로 추측된다. Choi 등(2001)의 연구에서 참취 데침 시간에 따른 플라보노이드 함량 분석 결과에서도 1분 데침에 비해 5분 데침 시 38.68% 더 감소되었다고 보고하였으며, 또한, 소금 첨가로 총플라보노이드와 총폴리페놀의 손실 억제 효과가 있는 것으로 보고하였다. Kim 등(1992)의 보고에 의하면 중조, 소금 등의 첨가는 데침 과정 중 데침 액의 용질이 높아지거나 pH를 변화시킴으로써 용출되는 성분에 영향을 미친 것으로 보고하였다. Kim과 Youn(2014)에 따르면 데침액에 용질로 0.1% sodium bicarbonate, 0.1% magnesium sulfate, 0.1% soluble Ca를 처리하였을 때, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 magnesium sulfate 데침 액에서 용출이 억제되는 정도가 가장 높았으며, 대조군에 비하여 용출되는 정도는 각각 9.67% 및 27.79% 억제되는 것으로 보고하였다. 따라서 추후 연구에서는 섬쑥부쟁이 데침 시 첨가되는 용질에 따른 유용성분들의 유출 방지 효과에 관한 구체적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.

Fig. 3. Changes in the contents of total flavonoids in Aster glehni based on blanching time. Total flavonids contents are expressed as catechin equivalents (CE). Values represent the mean±SD (n=3). Mean with different letters above a bar are significantly different at p⟨0.05.

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데침 시간에 따른 섬쑥부쟁이의 항산화 효과는 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능을 통해 확인하였다. DPPH는 비교적 안정한 라디칼을 갖는 물질로 항산화 물질이 전자 공여하여 산화를 억제하는 정도를 측정하는 방법으로, 시료와 에탄올에 용해되어 있는 짙은 보라색을 띠는 유리라디칼인 DPPH를 반응시켜 짙은 보라색이 탈색되어 색깔 변화를 측정한다(Gulcin 등, 2005). ABTS 라디칼 소거능은 ABTS 용액과 potassium persulfate 용액의 반응에 의해 생성된 청록색의 ABTS·⁺이 항산화 물질에 의해 제거되면 청록색이 탈색되는 색깔 변화를 측정하는 방법이다(Lee 등, 2011). 섬쑥부쟁이의 데침 시간에 따른 DPPH 라디칼 소거능은 데침 시간이 증가함에 따라 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다(p⟨0.05, Fig. 4). 1분간 데쳤을 때(82.64%)는 데침 전(81.79%)과 비교 시 통계적으로 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났지만, 2-5분으로 데침 시간이 경과함에 따라 각각 79.02%, 68.79%, 57.51%, 49.90%로 유의적으로 감소하였으며(p⟨0.05), 5분 데침 시 데침 전과 비교하여 38.99% 감소하였다. 섬쑥부쟁이의 ABTS 라디칼 소거능 또한 데침 시간에 의한 유의적인 영향을 받아 데침 시간이 경과할수록 항산화 활성이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다(p⟨0.05, Fig. 5). 데침 전 섬쑥부쟁이의 ABTS 라디칼 소거능(29.37%)은 1-5분으로 데침 시간이 증가함에 따라 각각 27.97%, 20.76%, 19.95%, 13.91%, 11.92%로 감소하였으며, 5분 데침 시 데침 전과 비교하여 59.41% 감소된 것으로 나타났다(Fig. 5). 이러한 결과는 항산화 효과를 나타내는 것으로 알려진 총폴리페놀 및 총플라보노이드 함량의 변화와 관계가 있을 것으로 사료된다. Kim과 Lee (2004)에 따르면 톳 조리 시 데침 시간이 경과함에 따라 무기질, 비타민, 총폴리페놀의 함량이 감소됨에 따라 항산화 활성 또한 감소됨을 확인해 상관성이 높은 것으로 보고하였다. 또한, Standley 등(2001)의 연구에서 채소류 조리 및 가공으로 폴리페놀 함량 감소와 항산화능 감소가 밀접한 관계가 있는 것으로 보고하였다. 본 연구 결과에서도 섬쑥부쟁이 데침 시 총폴리페놀 및 총플라보노이드가 용출되어, 그 함량 감소로 라디칼 소거능이 감소한 것으로 사료된다.

Fig. 4. Effects of blanching time on DPPH radical scavenging activity of Aster glehni. Values represent the mean±SD (n=3). Mean with different letters above a bar are significantly different at p⟨0.05.

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Fig. 5. Effects of blanching time on ABTS radical scavenging activity of Aster glehni. Values represent the mean±SD (n=3). Mean with different letters above a bar are significantly different at p⟨0.05.

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섬쑥부쟁이 비타민 B₂ HPLC 분석 크로마토그램은 Fig. 6과 같다. 비타민 B₂ 분석은 표준품 HPLC 분석 결과(Fig. 6(A))를 이용하여 y축 피크면적과 x축 표준품 용액의 농도 수준에 따른 기울기를 기반으로 한 linear regression equation을 계산하였다. 이때 작성된 검량선을 이용하여 FAD, FMN, 리보플라빈 성분의 R²값을 통하여 직선성을 확인한 결과, 0.999 이상으로 1에 가까운 것을 확인할 수 있었다(Table 1). 무처리 및 데침 후 비타민 B₂ HPLC 크로마토그램은 Fig. 6(B), (C)에 각각 나타내었으며, 무처리에 비해 데침 후 리보플라빈의 감소를 확인할 수 있었다. 비타민 B₂ 함량은 식품공전(MFDS, 2022)에 따라 FAD, FMN, 리보플라빈에 대한 면적을 검량선에 대입하여 나온 결과값을 riboflavin으로 환산하여 비타민 B₂ 함량을 나타내었다. 또한, 표준참고물질을 이용하여 비타민 B₂ 성분의 회수율 및 정확성을 검정하여 분석 품질을 확인한 결과, 94.48%, 107.24%의 회수율을 보여 정확도가 높은 분석이 실시되고 있음을 확인하였다(Table 2). 이러한 분석법으로 섬쑥부쟁이 데침 시간에 따른 비타민 B₂ 함량을 분석한 결과는 Fig. 7에 나타내었다. 본 연구에서 섬쑥부쟁이의 비타민 B₂ 함량은 무처리에 비해 데침 시간이 증가함에 따라 유의적으로 감소하였다(p=0.05). 데침 전 섬쑥부쟁이(1.17 mg/100 g dried sample)와 비교했을 때 1-5분 데침 시 비타민 B₂ 함량은 각각 22.30%, 44.28%, 49.13%, 61.46%, 68.56%로 감소하였다. Kim과 Park(2004)의 시금치 연구 결과에 의하면 무처리 시금치 시료에는 0.351 mg/100 g, 데침 시금치는 0.083 mg/100 g의 비타민 B₂를 함유한다고 하여 데침으로 인하여 76.35% 감소됨을 보고하였다. 이러한 결과는 데침 시간이 길어질수록 수용성 비타민이 조리수로 용출되어 나오기 때문이라고 할 수 있다(Chung 등, 2016). Kim 등(2012)은 식품을 삶거나 데치는 과정에서 조직의 연화와 파괴로 인해 수용성 비타민이 조리수로 용출되어 그 함량이 감소할 수 있다고 보고하였다. 본 연구 결과, 데침 공정에 의해 섬쑥부쟁이의 비타민 B₂ 함량의 감소는 수용성인 비타민 B₂가 데치는 과정 중 조리수로 용출되었기 때문으로 판단된다. Lim과 Yoon(1990)에 따르면 비타민 B₂ 잔존율은 일광에 노출이 된 경우에 손실이 많다고 보고하고 있으나, 본 연구 결과에 의하면 가수에 의한 열처리인 데침처리에 의해서도 영향을 받는 것으로 확인하였다. 영양성분인 비타민 B₂는 체내 지방 대사에 관여하여 결핍 시 지방산 산화 저하를 일으키며, 이러한 경향은 필수지방산의 체내 비율에 부정적인 영향을 미치게 되어 건강 기능성에 저해 요인으로 작용하는 것으로 보고되고 있다(Hoppel 등, 1979). Shaw와 Philips(1941)의 연구에 따르면 동물모델에서 리보플라빈의 결핍은 중추 및 말초 신경계 수초의 퇴화현상을 유발하는데, 이러한 요인을 앞서 언급한 필수지방산의 체내 비율 부족함으로 인한 문제로 제시하고 있다. 따라서 섬쑥부쟁이 데침 나물로 섭취 시 비타민 B₂의 손실 감소를 위해서는, 3분 이내로 데침을 해야 50% 이하의 손실로 영양적인 면에서 우수할 것으로 판단되며, 데침 공정에 의한 비타민 B₂의 손실을 줄일 수 있는 조리방법에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Fig. 6. HPLC chromatogram of vitamin B₂ standards (A), non-blanched (B) and blanched (C) Aster glehni powder. FAD, flavin adenine dinucleotide; FMN, flavin mononucleotide; RIB, riboflavin.

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Fig. 7. Changes in the contents of vitamin B₂ in Aster glehni based on blanching time. Vitamin B₂: FAD × 0.4537 + FMN × 0.7869 + Riboflavin. Values represent the mean±SD (n=3). Mean with different letters above a bar are significantly different at p⟨0.05.

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